数字定量PCR的核酸样品测量方法技术

本发明专利技术提供一种数字定量PCR(digital and quantitative PCR，dqPCR)的核酸样品测量方法，包括以下步骤。提供具有多个反应孔的测试载具，以对核酸样品进行数字定量PCR。特别是针对具有多个浓度范围差异较广的核酸标靶的待测核酸样品，可以同时以数字PCR及定量PCR测量，以定量核酸标靶的拷贝数。

The measurement of nucleic acid samples by digital quantitative PCR

【技术实现步骤摘要】
数字定量PCR的核酸样品测量方法
本专利技术涉及一种数字定量PCR的核酸样品测量方法，尤其涉及一种适于具有多个浓度范围差异较广的核酸标靶的待测核酸样品的测量方法。
技术介绍
现有数字PCR(digitalPCR)的优点是实验检测时不需要做检量线，即可直接测得样品浓度，但在实际应用上存在使用不便的缺点，原因在于，数字PCR主要利用卜瓦松分布(PoissonDistribution)来估算样品浓度，样品不可过浓而使全部的检测反应孔(well)都有阳性反应。亦即，若欲顺利通过数字PCR测量样品浓度，则必须使样品浓度低至某一程度，不可让全部的检测反应孔都分配到样品。如此一来，当面对未知浓度的样品时，需要先利用其他方式初步定量及稀释，使样品浓度落入数字PCR适用的浓度区间，才能够顺利的通过数字PCR测量样品浓度，因此，检测动态范围(dynamicrange)以及操作方便性皆会受限。一般而言，待测的核酸样品中，核酸标靶可能具有相距甚广的浓度范围，此现象在临床样品中尤其常见，其中若同时存在浓度较高及浓度较低的核酸标靶且以数字PCR测量时，则需针对核酸样品进行稀释，使浓度较高的核酸标靶落入数字PCR适用的浓度区间，方可通过数字PCR测量浓度较高的核酸标靶。然而，在稀释核酸样品的同时，虽使浓度较高的核酸标靶落入数字PCR适用的浓度区间，但也使浓度较低的核酸标靶过度稀释，而无法被检测到，导致敏感度降低的问题。此情况在液态切片(liquidbiopsy)样品的基因突变(genemutation)检测常会出现，例如浓度较高的原生型(wild-type)基因及浓度较低的突变型(mutation)基因同时存在待测核酸样品中，即会影响检测的敏感度。市面上目前多以增加检测反应孔数或droplet的方式，让高浓度核酸标靶分配后还可以有足够的阴性反应孔数目，以满足数字PCR的适用条件，测得待测样品的拷贝数。但增加检测反应孔会增加平台技术的困难度并增高检测成本及时间。基于上述，能使数字PCR在检测浓度较高的核酸标靶时，可不需要增加反应孔数目及稀释样品的情况下也能顺利地检测样品浓度，以改善动态范围以及操作方便性，为目前所需研究的重要课题。
技术实现思路
本专利技术提供一种核酸样品测量方法，同时进行即时定量聚合酶链式反应(qPCR)以及数字PCR的特性，可一次性检测同时存在的高浓度及低浓度核酸标靶，以拓展检测的动态范围，此方法称为数字定量PCR，具有数字PCR与定量PCR双功能。本专利技术的核酸样品测量方法，包括以下步骤。提供具有多个反应孔的测试载具，以对核酸样品进行数字定量PCR。其中低浓度核酸标靶以数字PCR的功能直接定量拷贝数，另外的高浓度核酸标靶以qPCR的功能检测其Cq值后，进行调整步骤，以得到高浓度核酸标靶在核酸样品中的拷贝数。在本专利技术的一实施例中，通过qPCR反应曲线得到PCR效率，之后进行调整步骤包括：将PCR效率加上1，作为底数。将低浓度核酸标靶的qPCRCq值减去高浓度核酸标靶的Cq值，得到ΔCq作为指数。之后，将底数与指数进行乘方运算，即得到每个反应孔的核酸标靶的拷贝数。再乘以数字PCR中的反应孔总数，以取得高浓度核酸标靶的总拷贝数。在本专利技术的一实施例中，核酸样品含有多于一种的所述核酸标靶，且多种所述核酸标靶具有不同的浓度范围。在本专利技术的一实施例中，使用64个以上的反应孔数目进行数字定量PCR反应。在本专利技术的一实施例中，使用64个至20000个反应孔数目进行数字定量PCR反应。在本专利技术的一实施例中，经调整步骤后，动态范围提高至9logs。在本专利技术的一实施例中，采用具2500个实验反应孔的检测载具，当核酸标靶为高浓度时(指全部的2500个实验反应孔针对核酸标靶都有阳性反应)，也就是核酸标靶在核酸样品中的拷贝数为大于10000。在本专利技术的一实施例中，当核酸标靶为低浓度时(指非全部的实验反应孔针对所述核酸标靶都有阳性反应时)，可直接测得所述核酸标靶在所述核酸样品中的拷贝数。在本专利技术的一实施例中，采用具2500个实验反应孔的检测载具，并非全部的2500个所述实验反应孔针对所述核酸标靶都有阳性反应时，所述核酸标靶在所述核酸样品中的拷贝数为10000以下。基于上述，本专利技术提供一种核酸样品测量方法(称为数字定量PCR)，其中低浓度核酸标靶以数字PCR的功能直接定量拷贝数，另外的高浓度核酸标靶以qPCR的功能检测其Cq值后，进行调整步骤，以得到高浓度核酸标靶的拷贝数。如此一来，能够使高浓度核酸标靶检测时，在不需要稀释样品的情况下也能顺利地检测样品浓度，可有效地改善检测动态范围以及操作方便性。为让本专利技术的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。附图说明图1及图2是依照本专利技术的实施例的一种核酸样品测量方法的检测结果，以示意本专利技术如何同时进行数字PCR与定量PCR双功能，达成9logs的动态范围，并以调整步骤将高浓度核酸标靶的qPCRCq值调整为高浓度核酸标靶的拷贝数。具体实施方式本专利技术提供一种核酸样品测量方法。下文中，先针对说明书内文所使用的名词加以定义说明。“qPCR”或“即时定量聚合酶链锁反应”(real-timequantitativePCR)是指使用PCR以扩增并同时定量目标DNA的实验方法。利用多种测定化学物质来进行定量(包括诸如green的荧光染料或Taqman探针的荧光报告寡核苷酸探针等)，随着每次扩增循环之后反应中积累的扩增DNA来对其进行即时定量。“数字PCR(digitalPCR)”是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接测量出核酸分子的拷贝数目。通过将一个样品分成几十到几万份，分配到不同的反应孔中，在每个反应孔中分别对核酸标靶进行PCR扩增，扩增结束后，对各个反应孔的荧光信号进行分析。“Cq值”为qPCR操作流程中，开始显著地增加荧光强度时的扩增循环数目。“PCR效率”指的是每经过一次PCR循环后核酸的增加量，通常好的设计会让效率在90％～110％之间，也就是每增加一个PCR循环后，核酸可增量90％～110％，本方法引用文献中利用荧光亮度增加量的方式来测量PCR效率(BiochemBiophysResCommun.2002Jun7；294(2):347-53)，PCR效率等于(RCq-RCq-1)/RCq-1，其中RCq是在Cq这个循环的荧光亮度，RCq-1是在Cq-1这个循环的荧光亮度，并且RCq与RCq-1都要先扣除荧光背景值。“样品”是指被测试的核酸样品。例如，样品可以是从血液、组织、唾液等来源中提取的核酸片段(包括DNA或RNA等)。模板(template)是指有具体序列的DNA或RNA或微RNA链，也被称为生物标记并且可以经由qPCR反应来检测。“具有多个反应孔的测试载具”是指具有多个反应孔的载片板，其中每个反应孔用来进行dqPCR反应。“动态范围”通常指的是线性动态范围，指的是一个区间的浓度范围，在这个区间的范围内，对已知的样品浓度(例如已知的序列稀释倍率)与其测量到的样品浓度呈现可接受的线性(Huggett,JimF.,etal."Guidelinesforminimuminformationforpublicationofquantitativedigi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸样品测量方法，同时进行数字PCR及定量PCR，以一次性检测具高浓度核酸标靶及低浓度核酸标靶的核酸样品，所述高浓度核酸标靶在所述核酸样品中的拷贝数为大于10000，所述低浓度核酸标靶在所述核酸样品中的拷贝数为10000以下。

【技术特征摘要】
2018.04.12 US 62/656,9681.一种核酸样品测量方法，同时进行数字PCR及定量PCR，以一次性检测具高浓度核酸标靶及低浓度核酸标靶的核酸样品，所述高浓度核酸标靶在所述核酸样品中的拷贝数为大于10000，所述低浓度核酸标靶在所述核酸样品中的拷贝数为10000以下。2.根据权利要求1所述的核酸样品测量方法，包括：提供具有多个反应孔的测试载具，以对所述核酸样品进行数字定量PCR；以及所述低浓度核酸标靶以数字PCR直接定量拷贝数，所述高浓度核酸标靶以qPCR检测其Cq值后，进行调整步骤，以得到所述高浓度核酸标靶在所述核酸样品中的拷贝数。3.根据权利要求2所述的核酸样品测量方法，其中通过qPCR反应曲线得到PCR效率，再进行所述调整步骤，所述调整步骤包括：将PCR效率加上1，作为底数；将所述低浓度核酸标靶的Cq值减去所述高浓度核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：味正唯，黄章维，
申请(专利权)人：奎克生技光电股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71