用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的核酸试纸条法及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的核酸试纸条法及其应用。本发明专利技术首先提供了一种特异引物组，由引物PSPL‑BF、引物PSPL‑MBF、引物PSPL‑DF、引物PSPL‑CPR和引物PSPL‑BR组成，上述各个引物依次如序列表的序列1至5所示。所述特异引物组的用途为鉴定黄瓜细菌性角斑病菌或检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌。本发明专利技术具有特异性好，灵敏度高，操作简便，检测效率高等优点，能满足口岸和田间检测的基本要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物检疫
，涉及生物检测技术，具体涉及一种用于黄瓜细菌性角斑病菌的核酸试纸条检测法以及应用该方法鉴定黄瓜细菌性角斑病菌或含有黄瓜细菌性角斑病菌的植物材料的方法。
技术介绍
黄瓜细菌性角斑病是黄瓜的重要病害之一，在我国各地均有发生，随着黄瓜大面积种植，黄瓜细菌性角斑病使得黄瓜减产情况逐年加重。黄瓜细菌性角斑病的病原菌为Pseudomonas syringae pv.Lachrymans，该致病菌的主要寄主为黄瓜，此外还会侵染葫芦、甜瓜、西葫芦和丝瓜。黄瓜染病初期出现黄色褪绿的斑点，叶背为水浸状病斑，染病后期由于叶脉的阻挡，病斑呈现不规则多边形，随着病斑开裂，叶片干枯脱落。黄瓜细菌性角斑病菌的检测方法主要基于形态学特征、致病性测定、培养性状和血清学反应鉴定以及实时荧光PCR等，耗时长、灵敏度低或需要昂贵的操作仪器，不利于在基层单位的推广使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的核酸试纸条法及其应用。本专利技术首先提供了一种特异引物组，由引物PSPL-BF、引物PSPL-MBF、引物PSPL-DF、引物PSPL-CPR和引物PSPL-BR组成；所述引物PSPL-BF为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-MBF为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-DF为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-CPR为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-BR为如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。所述特异引物组为基于交叉引物恒温扩增原理设计的引物组。引物PSPL-MBF的5'末端进行生物素标记。引物PSPL-DF的5'末端进行6-FAM标记。所述特异引物组的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)鉴定黄瓜细菌性角斑病菌；(b2)制备用于鉴定黄瓜细菌性角斑病菌的试剂盒；(b3)检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌；(b4)制备用于检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌的试剂盒。本专利技术还保护所述特异引物组的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)鉴定黄瓜细菌性角斑病菌；(b2)制备用于鉴定黄瓜细菌性角斑病菌的试剂盒；(b3)检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌；(b4)制备用于检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌的试剂盒。本专利技术还保护含有所述特异引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定黄瓜细菌性角斑病菌；(c2)检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌。所述试剂盒还可包括用于交叉引物恒温扩增的试剂，例如Bst DNA聚合酶。所述试剂盒还可包括一次性核酸检测装置。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本专利技术还保护一种鉴定黄瓜细菌性角斑病菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待测细菌的基因组DNA；(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述特异引物组可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测细菌为或候选为黄瓜细菌性角斑病菌；如果采用所述特异引物组不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测细菌为或候选为非黄瓜细菌性角斑病菌。本专利技术还保护一种鉴定黄瓜细菌性角斑病菌的方法，包括如下步骤：以待测细菌为模板，采用所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述特异引物组可以实现以所述待测细菌为模板的特异性扩增，待测细菌为或候选为黄瓜细菌性角斑病菌；如果采用所述特异引物组不能实现以所述待测细菌为模板的特异性扩增，待测细菌为或候选为非黄瓜细菌性角斑病菌。本专利技术还保护一种鉴定黄瓜细菌性角斑病菌的方法，包括如下步骤：检测待测细菌的基因组DNA中是否含有所述特异引物组的靶序列，然后进行如下判断：如果待测细菌的基因组DNA中含有所述特异引物组的靶序列，待测细菌为或候选为黄瓜细菌性角斑病菌；如果待测细菌的基因组DNA中不含有所述特异引物组的靶序列，待测细菌为或候选为非黄瓜细菌性角斑病菌。本专利技术还保护一种鉴定待测植物材料是否含有黄瓜细菌性角斑病菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待测植物材料的总DNA；(2)以步骤(1)得到的总DNA为模板，采用所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述特异引物组可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测植物材料含有或疑似含有黄瓜细菌性角斑病菌；如果采用所述特异引物组不能实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测植物材料不含有或疑似不含有黄瓜细菌性角斑病菌。本专利技术还保护一种鉴定待测植物材料是否含有黄瓜细菌性角斑病菌的方法，包括如下步骤：检测待测植物材料的总DNA中是否含有所述特异引物组的靶序列，然后进行如下判断：如果待测植物材料的总DNA中含有所述特异引物组的靶序列，待测植物材料含有或疑似含有黄瓜细菌性角斑病菌；如果待测植物材料的总DNA中不含有所述特异引物组的靶序列，待测植物材料不含有或疑似不含有黄瓜细菌性角斑病菌。本专利技术还保护所述特异引物组的靶序列或所述特异引物组的靶序列的应用；所述应用为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定黄瓜细菌性角斑病菌；(c2)检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌。以上任一所述方法中，交叉引物恒温扩增的反应体系中，引物PSPL-CPR的浓度为1.5μmol/L、引物PSPL-MBF的浓度为0.9μmol/L、引物PSPL-DF的浓度为0.9μmol/L、引物PSPL-BF的浓度为0.3μmol/L、引物PSPL-BR的浓度为0.3μmol/L。以上任一所述方法中，交叉引物恒温扩增的反应体系中，引物PSPL-CPR的浓度为1.5μmol/L、5'末端具有生物素标记的引物PSPL-MBF的浓度为0.9μmol/L、5'末端具有6-FAM标记的引物PSPL-DF的浓度为0.9μmol/L、引物PSPL-BF的浓度为0.3μmol/L、引物PSPL-BR的浓度为0.3μmol/L。以上任一所述方法中，交叉引物恒温扩增的反应体系如下(20μl)：引物PSPL-CPR1.5μmol/L、5'末端具有生物素标记的引物PSPL-MBF 0.9μmol/L、5'末端具有6-FAM标记的引物PSPL-DF 0.9μmol/L、引物PSPL-BF 0.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异引物组，由引物PSPL‑BF、引物PSPL‑MBF、引物PSPL‑DF、引物PSPL‑CPR和引物PSPL‑BR组成；所述引物PSPL‑BF为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL‑MBF为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL‑DF为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL‑CPR为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL‑BR为如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.特异引物组，由引物PSPL-BF、引物PSPL-MBF、引物PSPL-DF、引物PSPL-CPR和引物PSPL-BR组成；所述引物PSPL-BF为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-MBF为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-DF为如下(a5)或(a6)；(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-CPR为如下(a7)或(a8)；(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物PSPL-BR为如下(a9)或(a10)；(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述特异引物组的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)鉴定黄瓜细菌性角斑病菌；(b2)制备用于鉴定黄瓜细菌性角斑病菌的试剂盒；(b3)检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌；(b4)制备用于检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌的试剂盒。3.含有权利要求1所述特异引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定黄瓜细菌性角斑病菌；(c2)检测待测植物样本中是否含有黄瓜细菌性角斑病菌。4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。5.一种鉴定黄瓜细菌性角斑病菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待测细菌的基因组DNA；(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述特异引物组可以实现以所述基因组DNA为模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵文军，霍亚云，张永江，李为民，朱罗罗，胡林，尤其敏，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，中国农业科学院生物技术研究所，杭州优思达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11