一种联合检测EGFR基因突变的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种联合检测人类EGFR基因突变检测试剂盒，本发明专利技术包括的引物和探针包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32；可以对EGFR1基因上T790M、L858R、19del、G719X，S768I和L861Q突变进行检测，可以在一个反应管中同时检测出多种突变；灵敏度较高，可以检测出3‑10拷贝数；高特异性，10ng/ul野生型质粒不会产生非特异性信号；检测快速高效，操作简单，费用低廉。

A kit and method for detecting EGFR gene mutation

【技术实现步骤摘要】
一种联合检测EGFR基因突变的试剂盒及方法本申请主张中国在先申请，申请号201910238686.0申请日：2019年3月27日的优先权。
本专利技术涉及生物技术和医学领域，具体涉及基于荧光探针和聚合酶链式反应(PCR)的EGFR基因突变检测试剂盒及方法。
技术介绍
目前，肺癌已成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万，严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占85％，且就诊时80％已失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌2年生存率仅10.20％，中位生存时间仅10-12月。因此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶向治疗为代表的新治疗方法，为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望和曙光。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是目前NSCLC治疗最重要的分子靶点，其是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，基因定位于第7号染色体短臂(7p12)，全长200Kb，由28个外显子组成。C-ErbB-1的编码产物EGFR为含有1210个氨基酸残基的单一多肽链前体，其中24个氨基酸为信号肽段，在翻译加工时被裂解，故成熟的EGFR是由1186个氨基酸组成的酪氨酸蛋白激酶，分子量约为170KDa。肺腺癌患者EGFR基因敏感性突变阳性率在亚裔人群和我国均为50％左右。随着对非小细胞肺癌发病机制进一步的研究以及对其分子生物学行为的深入探讨，有针对性的分子药物靶向治疗成为治疗晚期非小细胞肺癌很有前景的治疗方式。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitors,EGFR-TKIs)包括厄洛替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)等，在治疗晚期NSCLC方面发挥了很重要的作用，效果显著，现已成为一线药物，为患者的治疗带来的很大的希望，广泛受到大家的认可。EGFR-TKIs在改善晚期非小细胞肺癌患者总生存期和无进展生存期方面有很显著的作用，然而，经过一段时间的临床治疗后，发现有一大部分患者会对EGFR-TKIs产生耐药性，大大限制了临床的应用，所以进一步分析研EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中经常过表达，与肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR常发生突变，其酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21号外显子，在中国肺癌患者中，EGFR突变率占30-50％，其中19和21号(L858R,L861I)外显子突变率占总突变率的90％左右，18号外显子突变占总突变率的5％左右，20号外显子上T790M突变占突变率的5％左右。目前EGFR基因突变的检测方法主要包括以下几种：(1)Sanger测序法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。测序的过程检测周期较长且较繁琐，消费昂贵，通量不高，灵敏度较小，只能检测突变比例在10％-20％以上的基因突变，因此不适用于临床上大量样本的分析与研究。(2)限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析技术是分子生物学的重要分析方法之一，用于检测DNA序列多态性。PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型的方法，该方法实验操作较繁琐，耗时较长，非闭管操作，容易引起污染造成假阳性。(3)高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，HRM)是一种通过饱和染料结合于PCR扩增产物实时监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有较高的敏感性，在5％左右，但是不能判定阳性结果中基因突变的具体位置，还需要通过测序法或其他方法来进行确认。(4)扩增阻滞突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)是根据引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能进行有效扩增的原理，因为PCR扩增时TaqDNA聚合酶缺乏3’端到5’端的外切酶活性，不能及时修正3’端的错配碱基，使得PCR反应无法继续。基于此，设计针对基因突变位点的引物序列，一个与正常基因序列互补，一个与突变基因序列互补，则可以分别检测突变的基因和未突变的基因的量，该检测方法的灵敏度在1％左右。但是该方法引物中一个碱基不匹配并不能完全阻断野生型基因的扩增，可能存在假阳性的风险。肽核酸(PeptideNucleicAcid，PNA)，是具有肽键骨架的DNA类似物，其主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的，可特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的三链复合物结构DNA/(PNA)2，不易被蛋白酶和核酸酶降解，受盐浓度影响小，一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20℃，能够排除非特异的结合。本专利技术提供一种高灵敏度和搞特异性的用于检测人类EGFR基因突变的试剂盒，结合ARMS和PNA探针两种技术。该试剂盒通过采用设计一段涵盖突变位点的14-20bp长度的PNA探针，其序列与野生型序列完全匹配，当PCR的模板为野生型时，PNA与其完全匹配，引物延伸受阻，扩增受到强烈的抑制作用，而当模板为突变型时，PNA与其会产生错配，杂交能力消失，引物延伸不受到影响，扩增反应可正常进行，应用此方法可以很大程度上提高反应的特异性，检测基因突变的灵敏度一般在0.01％左右。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测EGFR各突变位点的检测试剂盒，包括19号外显子缺失，21外显子L858R替代突变，T790M耐药突变以及L861Q，G719X，S768I等罕见突变的检测。检测结果可供临床医生为肺癌患者选择靶向药作为参考依据。本专利技术的技术方案的原理在于设计针对野生型EGFR基因(包括18-21外显子)序列的核肽酸PNA探针或阻断剂，它们能与野生型基因特异性结合，阻断野生型基因的扩增，目的是为了在EGFR突变基因存在的情况下不干扰突变基因的扩增，即可以将EGFR基因突变型和野生型区分开。本专利技术的技术方案如下：用于检测EGFR基因(包括18-21外显子)6种突变的具体的引物探针序列以及阴性质控和阳性质控的引物序列如下表所示：所述TaqMan探针5’端连接荧光报告基团，如FAM,VIC,ROX,CY5或HEX，3’端连接荧光淬灭基团BHQ。优选的，所述试剂盒包括引物对，TaqMan探针，PNA探针，阻断剂Blocker，qPCR缓冲液，dNTPs，MgCl2，TaqDNA聚合酶，各组分的最终浓度比例为：优选的，所述试剂盒25ul体系PCR反应体系为：组分加样量qPCR缓冲液5uldNTPs2ulMgCl22ulForwardPrimer/ReversePrimer0.3-0.6ulTaqMan探针0.3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种联合检测人类EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括TaqMan探针，PNA探针，阻断剂Blocker，引物对，阳性质控和阴性质控。

【技术特征摘要】
2019.03.27 CN 20191023868601.一种联合检测人类EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括TaqMan探针，PNA探针，阻断剂Blocker，引物对，阳性质控和阴性质控。2.如权利要求1所述的TaqMan探针，其特征在于，其探针序列为SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、SEQIDNO:14、SEQIDNO:17、SEQIDNO:20的至少15个连续核苷酸。探针5’端被荧光报告基团FAM和VIC等修饰，3’端被荧光淬灭基团MGB，BHQ1等修饰。3.如权利要求1所述的PNA探针，其特征在于，其探针序列为SEQIDNO:10的至少15个连续核苷酸，探针无任何修饰，与包含突变位点野生型EGFR序列完全互补配对。4.如权利要求1所述的21外显子阻断剂Blocker，其特征在于，其序列为SEQIDNO:11的至少15个连续核苷酸。5.如权利要求1所述的引物对具体包括：(1)针对20号外显子T790M替代突变的引物对序列分别包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的至少连续15个核苷酸；(2)针对21号外显子L858R替代突变的引物对序列分别包括SEQIDNO:4和SEQIDNO:5的至少连续15个核苷酸；(3)针对19号外显子缺失的引物对序列分别包括SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭兴中，
申请(专利权)人：杭州丹威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33