一种检测PON1基因SNP位点的引物组、引物组的设计方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种检测PON1基因SNP位点的引物组、引物组的设计方法及其应用，所述引物组的设计方法包括以下步骤：(1)以野生型基因为模板，设计扩增SNP位点的上游引物，所述SNP位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端SNP位点的非SNP位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述引物组。本发明专利技术的上游引物的3’端与突变型基因不互补匹配，同时在上游引物的靠近3’端SNP位点的非SNP位点突变至少一个碱基，使野生型基因和突变型基因不容易被同时扩增出条带，从而使得所述引物组可以成功区分野生型基因和突变型基因。

【技术实现步骤摘要】
一种检测PON1基因SNP位点的引物组、引物组的设计方法及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种检测SNP位点的引物组、引物组的设计方法及其应用，尤其涉及一种检测PON1基因SNP位点的引物组、引物组的设计方法及其应用。
技术介绍
PON1基因产物，即血清对氧磷酶，不仅在有机磷神经毒剂解毒中起重要作用，而且与动脉粥样硬化、冠心病和II型糖尿病等疾病有密切关系。PON1是氯吡格雷代谢过程中的一种限速酶，在氯吡格雷转化为有活性的硫醇的过程中起到重要作用。氯吡格雷可用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑和其他动脉循环障碍疾病，如近期发作的脑卒中、心肌梗死和确诊的外周动脉疾病。目前，常用的基因分型方法主要有：1)基于凝胶电泳的基因分型技术，如：PCR反应结合限制性酶切片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)、等位基因特异性扩增法等；2)基于荧光标记杂交反应的基因分型技术，如：寡核苷酸连接分析、焦磷酸DNA测序、直接杂合子测序、等位基因特异性引物延伸等；3)基因芯片技术。其中，基于凝胶电泳的基因分型技术和基于荧光标记杂交反应的基因分型技术都是在PCR扩增反应之后，采用不同的方法检测多态性位点，操作繁琐，检测周期长，检测结果准确度低，不能满足临床快速、高效、灵敏的检测要求。基因芯片技术通过将数以万计、乃至百万计的特定DNA片段作为基因探针，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成一个二维DNA探针阵列，利用芯片与标记的生物样品进行杂交，实现对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。基因芯片技术由于高通量等优点在基因多态性检测中得到广泛应用，一次实验即可高通量检测所有待测样本的基因信息，简单、快速，但存在检测时条件难以控制、重复性差、准确性低、检测成本高昂、灵敏度较低等缺点，且现有的基因芯片大多仅能同时检测基因的1个基因型，能够同时检测2个基因型的研究较少。JadwigaOczos等采用DNA测序技术进行PON1基因分型(PMID：22956172)，检测了PON1的多态性位点包括rs705380和rs854572，但所述方法步骤繁琐，成本较高，而且不能同时检测多个位点。因此，开发一种特异性好、灵敏度高、成本低的同时检测2个PON1的SNP位点rs705380和rs854572的引物组、试剂盒与方法，为临床制定合理用药方案、确定最佳治疗剂量、避免和减少不良反应提供指导依据，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种检测PON1基因SNP位点的引物组、引物组的设计方法及其应用，所述引物组特异性针对PON1基因上对氯吡格雷代谢有明显影响的rs705380-126C>G位点和rs85457295325384C>G位点，可以区分野生型和突变型，实现了根据产物的电泳条带的数量和大小快速准确检测PON1基因的多态性的效果。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种引物组的设计方法，所述方法包括以下步骤：(1)以野生型基因为模板，设计扩增SNP位点的上游引物，所述SNP位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端的SNP位点的非SNP位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述引物组。本专利技术中，通过在上游引物的靠近3’端SNP位点的非SNP位点突变至少一个碱基，使得野生型基因和突变型基因不易同时扩出条带，并且引物在3’端的SNP位点对于野生型基因和突变型基因的差异有利于通过PCR和琼脂糖凝胶电泳区分野生型基因和突变型基因。本专利技术中，利用引物设计软件，选择与上游引物最佳配对的下游引物，控制引物长短以调节Tm值，并调整上下游引物之间的距离以便区分不同的PCR产物的大小，最终得到的引物组可用于多重PCR。根据本专利技术，步骤(2)中对上游引物进行碱基突变，突变碱基的个数为至少一个，优选为1-5个，例如可以是1个、2个、3个、4个或5个，进一步优选为1-3个，最优选为最靠近3’端SNP位点的2个非SNP位点里的1-2个。优选地，所述rs705380-126C>G位点的引物组的设计方法包括以下步骤：(1)以野生型PON1基因为模板，设计扩增rs705380-126C>G位点的上游引物，所述rs705380-126C>G位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端rs705380-126C>G位点的非rs705380-126C>G位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型PON1基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述rs705380-126C>G位点的引物组。根据本专利技术，步骤(2)中对上游引物进行碱基突变，突变碱基的个数为至少一个，优选为1-5个，例如可以是1个、2个、3个、4个或5个，进一步优选为1个。优选地，所述rs85457295325384C>G位点的引物组的设计方法包括以下步骤：(1)以野生型PON1基因为模板，设计扩增rs85457295325384C>G位点的上游引物，所述rs85457295325384C>G位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端rs85457295325384C>G位点的非rs85457295325384C>G位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型PON1基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述rs85457295325384C>G位点的引物组。根据本专利技术，步骤(2)中对上游引物进行碱基突变，突变碱基的个数为至少一个，优选为1-5个，例如可以是1个、2个、3个、4个或5个，进一步优选为1个。第二方面，本专利技术提供了一种检测SNP位点的引物组，所述引物组采用如第一方面所述的方法设计得到。优选地，所述引物组包括针对rs705380-126C>G位点的引物组和/或针对rs85457295325384C>G位点的引物组；其中，针对rs705380-126C>G位点的上游引物如SEQIDNO:1所示，针对rs85457295325384C>G位点的上游引物如SEQIDNO:3所示；SEQIDNO:1所示的核酸序列为：5’-CCCTCCCCGCCGGGACC-3’；SEQIDNO:3所示的核酸序列为：5’-TGCCTCTGTACAACCATGAC-3’。优选地，针对rs705380-126C>G位点的下游引物如SEQIDNO:2所示，针对rs85457295325384C>G位点的下游引物如SEQIDNO:4所示；SEQIDNO:2所示的核酸序列为：5’-CCCTCCCTTCCGCACCTTTT-3’；SEQIDNO:4所示的核酸序列为：5’-CTCATAGCCACATTGGACACAGA-3’。本专利技术中，特异性选择PON1基因上对氯吡格雷代谢有明显影响的rs705380-126C>G位点和rs85457295325384C>G位点设计引物组，进行多重PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组的设计方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)以野生型基因为模板，设计扩增SNP位点的上游引物，所述SNP位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端SNP位点的非SNP位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述引物组。

【技术特征摘要】
1.一种引物组的设计方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)以野生型基因为模板，设计扩增SNP位点的上游引物，所述SNP位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端SNP位点的非SNP位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述引物组。2.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述rs705380-126C>G位点的引物组的设计方法包括以下步骤：(1)以野生型PON1基因为模板，设计扩增rs705380-126C>G位点的上游引物，所述rs705380-126C>G位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端rs705380-126C>G位点的非rs705380-126C>G位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型PON1基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述rs705380-126C>G位点的引物组。3.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述rs85457295325384C>G位点的引物组的设计方法包括以下步骤：(1)以野生型PON1基因为模板，设计扩增rs85457295325384C>G位点的上游引物，所述rs85457295325384C>G位点位于上游引物的3’端；(2)在所述上游引物的靠近3’端rs85457295325384C>G位点的非rs85457295325384C>G位点，突变至少一个碱基，使突变后的上游引物与野生型PON1基因和突变型基因在突变碱基处均不互补；(3)依据设计的上游引物，选择下游引物，得到所述rs85457295325384C>G位点的引物组。4.一种检测SNP位点的引物组，其特征在于，所述引物组采用如权利要求1-3任一项所述的方法设计得到。5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括针对rs705380-126C>G位点的引物组和/或针对rs85457295325384C>G位点的引物组；其中，针对rs705380-126C>G位点的上游引物如SEQIDNO:1所示，针对rs85457295325384C>G位点的上游引物如SEQIDNO:3所示。6.根据权利要求5所述的引物组，其特征在于，针对rs705380-126C...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵凤，周素凤，邓文杰，朱佑民，杨平，孙健，王璐，赵玉清，丁思加，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32