一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法及试剂技术

本发明专利技术属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR‑SBT方法。本发明专利技术还涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂。本发明专利技术所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了KIR3DL2精确分型的问题，发挥PCR‑SBT对KIR3DL2分型操作简便、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

PCR-SBT method and reagent for genotyping human killer cell immunoglobulin receptor kir3dl2

【技术实现步骤摘要】
一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法及试剂
本专利技术属于基因分型检测方法
，具体涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法。本专利技术还涉及一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型试剂。
技术介绍
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)属于免疫球蛋白样超家族，主要表达于NK细胞和T细胞表面，通过与靶细胞表面的HLA-I类分子(配基)相互作用传导抑制或者激活信号，从而调节NK细胞和T细胞的抑制和杀伤活性，在肿瘤免疫、清除老化变异细胞、抗感染免疫、母胎耐受、器官移植和自身免疫性疾病等生理病理过程中起着重要的作用。KIR3DL2属于抑制性KIR基因，研究显示这些抑制性KIR基因具有高度遗传多态性，分析明确其在人群中的分布对于研究调控NK细胞功能具有重要的意义。KIR3DL2基因位于第19号染色体，由9个外显子编码。目前实验室检测KIR3DL2基因常见的分型技术为PCR-SSP、PCR-SSOP和PCR-SBT方法，前两种方法只能提供低分辨的结果，尚无法确定其等位基因型；PCR-SBT的方法可以提供高分辨的结果，但是由于KIR基因的特殊性，同一个基因座位上可能同时存在一个以上的等位基因，而且KIR基因家族具有高度相似性，KIR高分辨检测存在一定的难度，目前国外仅有少数实验室开展KIR3DL2基因的高分辨研究工作。现有的PCR-SBT方法只是针对KIR3DL2基因部分外显子，随着KIR3DL2新等位基因的不断发现，先前的方法如不及时进行改进和提升，则存在着漏检和错检的可能。因此有必要系统建立一种针对KIR3DL2基因编码区全长序列的高分辨分型的方法来解决目前的问题。本专利技术提供了一种针对KIR3DL2基因全部编码区序列进行扩增和测序的PCR-SBT方法，最终获得准确的KIR3DL2高分辨分型的结果。
技术实现思路
针对现有技术中KIR3DL2基因分型技术的缺陷，本专利技术的第一个目的在于提供了一种用于人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL2基因的PCR-SBT高分辨测序分型方法，本专利技术所提供的方法可以对KIR3DL2基因全部编码区序列进行分析，获得准确的KIR3DL2等位基因分型结果，解决了现有KIR3DL2基因分型技术存在的问题。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：(1)设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；(2)制备人基因组DNA；(3)分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；所述步骤(1)中PCR扩增引物序列分别为：KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：5UTR5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'I2R5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：E1F5'-GTCGTCAGCATGGYGTGC-3'i6R5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：F35'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'E9R5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：E7F5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'3UTR5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'；所述步骤(3)中4组PCR反应体系包括：第1组扩增KIR3DL2基因第1号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50μM，5UTR和I2R各0.2μl，引物0.2μl；5U/μlLA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μlDNA2.5μl；以H2O15.6μl补足至25μl；第2组扩增KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50μM，E1F和i6R各0.2μl；5U/μlLA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μlDNA2.5μl；以H2O15.6μl补足至25μl；第3组扩增KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50μM，F3和E9R各0.2μl；5U/μlLA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μlDNA2.5μl；以H2O15.6μl补足至25μl；第4组扩增KIR3DL2基因第9号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50μM，E7F和3UTR各0.2μl；5U/μlLA-Taq酶0.2μl；50-100ng/μlDNA2.5μl；以H2O15.6μl补足至25μl。在采用上述技术方案的同时，本专利技术还可以采用或者组合采用如下技术方案：作为本专利技术的优选技术方案，所述步骤(3)中PCR反应程序包括3组，分别为：第1组用于扩增第1号外显子和第9号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，66℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；第2组用于扩增第2号外显子至第6号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃退火45s，72℃延伸8min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；第3组用于扩增第6号外显子至第9号外显子的反应程序：94℃预变性1min，98℃变性10s，68℃延伸10min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃。作为本专利技术的优选技术方案，所述步骤(5)中寡核苷酸测序引物序列分别如下：5UTR5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'I2R5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'i1SF15'-CTGTTCTTGGCAGCAGGTA-3'i2R25'-GTCTCACCCCAGTCTTCAC-3'i2F25'-CTTAGAAAGYGGAAATGGGAG-3'i3R25'-ACAGTKATTCTTCCCACCACA-3'i3F15'-AAGACAAATGGAGGGACCTG-3'i4R15'-CCTCACCGAGTCAGTCTCT-3'i4F15'-GGAAATAGACATGAAGAGAGT-3'i5SR15'-GTCTTCGTGTTCTCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR‑SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：（1）设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；（2）制备人基因组DNA；（3）分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；（4）将步骤（3）得到的扩增产物进行双酶切纯化；（5）提供寡核苷酸测序引物，将步骤（4）得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；（6）将步骤（5）得到的测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；（7）将步骤（6）获得的序列通过软件分析，确定其基因型；所述步骤（1）中PCR扩增引物序列分别为：KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：5UTR 5'‑GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA‑3'I2R 5'‑TTGGGGAMGGACTCACCCATGA‑3'KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：E1F 5'‑GTCGTCAGCATGGYGTGC‑3'i6R 5'‑AGACAGGCCCTCATTCACAG‑3'KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：F3 5'‑CTTCACCCACAGAACCAAGC‑3'E9R 5'‑CTTCACCCACAGAACCAAGC‑3'KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：E7F 5'‑CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT‑3'3UTR 5'‑CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA‑3'；所述步骤（3）中4组PCR反应体系包括：第1组扩增KIR3DL2基因第1号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50µM，5UTR和I2R各0.2µl，引物0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H2O 15.6µl补足至25µl；第2组扩增KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50µM，E1F 和i6R各0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H2O 15.6µl补足至25µl；第3组扩增KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50µM，F3和E9R各0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H2O 15.6µl补足至25µl；第4组扩增KIR3DL2基因第9号外显子的反应体系：10×LA buffer 2.5μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；25 mM MgCl2 1.8μl；引物浓度50µM，E7F和3UTR各0.2µl；5U/µl LA‑Taq酶0.2µl；50‑100 ng/µl DNA 2.5µl；以H2O 15.6µl补足至25µl。...

【技术特征摘要】
1.一种人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对KIR3DL2基因编码区全长序列包括第1号外显子至第9号外显子进行分组PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：（1）设计并合成PCR扩增引物和测序引物，针对KIR3DL2基因特异性序列；（2）制备人基因组DNA；（3）分四组PCR反应扩增人基因组DNA中KIR3DL2基因第1号外显子至第9号外显子序列；（4）将步骤（3）得到的扩增产物进行双酶切纯化；（5）提供寡核苷酸测序引物，将步骤（4）得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；（6）将步骤（5）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；（7）将步骤（6）获得的序列通过软件分析，确定其基因型；所述步骤（1）中PCR扩增引物序列分别为：KIR3DL2基因第1号外显子的扩增引物：5UTR5'-GCCTCATGCAAGGTAGAAAGA-3'I2R5'-TTGGGGAMGGACTCACCCATGA-3'KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的扩增引物：E1F5'-GTCGTCAGCATGGYGTGC-3'i6R5'-AGACAGGCCCTCATTCACAG-3'KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的扩增引物：F35'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'E9R5'-CTTCACCCACAGAACCAAGC-3'KIR3DL2基因第9号外显子的扩增引物：E7F5'-CATCCTCCTCCTCTTCTTTCTCCTTT-3'3UTR5'-CAGAAGGCTGAAAGATAGTCTGA-3'；所述步骤（3）中4组PCR反应体系包括：第1组扩增KIR3DL2基因第1号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50µM，5UTR和I2R各0.2µl，引物0.2µl；5U/µlLA-Taq酶0.2µl；50-100ng/µlDNA2.5µl；以H2O15.6µl补足至25µl；第2组扩增KIR3DL2基因第2号外显子至第6号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50µM，E1F和i6R各0.2µl；5U/µlLA-Taq酶0.2µl；50-100ng/µlDNA2.5µl；以H2O15.6µl补足至25µl；第3组扩增KIR3DL2基因第6号外显子至第9号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50µM，F3和E9R各0.2µl；5U/µlLA-Taq酶0.2µl；50-100ng/µlDNA2.5µl；以H2O15.6µl补足至25µl；第4组扩增KIR3DL2基因第9号外显子的反应体系：10×LAbuffer2.5μl；2.5mMdNTP2.0μl；25mMMgCl21.8μl；引物浓度50µM，E7F和3UTR各0.2µl；5U/µlLA-Taq酶0.2µl；50-100ng/µlDNA2.5µl；以H2O15.6µl补足至25µl。2.根据权利要求1所述的人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL2基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述步骤（3）中PCR反应程序包括3组，分别为：第1组用于扩增第1号外显子和第9号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，66℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；第2组用于扩增第2号外显子至第6号外显子的反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃退火45s，72℃延伸8min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃；第3组用于扩增第6号外显子至第9号外显子的反应程序：94℃预变性1min，98℃变性10s，68℃延伸10min，30个循环，72℃延伸10min，然后冷却至12℃。3.根据权利要求1所述的人类杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR3DL...

【专利技术属性】
技术研发人员：和艳敏，朱发明，何吉，陶苏丹，陈晨，章伟，
申请(专利权)人：浙江省血液中心，
类型：发明
国别省市：浙江,33