本发明专利技术提供了一种Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其包括以下三组针对Septin 9‑v2外显子甲基化检测的特异性引物和探针中的至少一组，SEQ ID NO.5‑SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8‑SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11‑SEQ ID NO.13。本发明专利技术还提供了一种Septin 9基因甲基化检测方法以及样品前处理方法，其包括以下步骤：TET酶氧化；吡啶硼烷反应；多重荧光PCR反应。本发明专利技术所述试剂盒和检测方法，具有检测灵敏度高、特异性好，检测通量高的优点。
A Method and Kit for Detecting Methylation of Septin 9 Gene
【技术实现步骤摘要】
一种Septin9基因甲基化检测的方法及试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及一种人类基因甲基化检测的方法及试剂盒。
技术介绍
Septin9基因是Hartwell等发现的Septin基因家族成员之一，具有鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性。Septin9基因位于人类染色体17q25.3，含有17个外显子，长约2.40×105bp，编码Septin9蛋白。但由于其转录产物包含多个翻译起点和变异剪接，Septin9可变异产生18种变异剪接体、编码15种多肽。Septin9各亚型之间具有75％的核苷酸序列相似性和89％～96％的氨基酸一致性。此外，这些变异剪接体的分布有组织特异性，如Septin9基因的变异剪接体Septin9-v1分布于除脑部和胸腺外的组织，变异剪接体Septin9-v2、Septin9-v3、Septin9-v4多在胎儿组织中表达，变异剪接体Septin9-v5在胎儿组织中表达很高。Septin9基因及其表达产物广泛参与人体各种生理过程，如细胞极化、细胞增殖与凋亡、细胞内外物质运输、细胞骨架调节等。研究表明，Septin9基因在结直肠癌发生中起抑癌基因作用，其甲基化会抑制其基因正常表达，使其抑癌功能丧失，并最终导致细胞分裂和癌变。DNA甲基化的检测手段繁多，根据样本预处理不同可分为3大类，分别为酶消化法、亲和富集法、重亚硫酸盐转化法。目前针对于结直肠癌样本的Septin9甲基化检测主要为重亚硫酸盐转化法。该方法采用亚硫酸氢盐处理样本DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而发生甲基化的胞嘧啶(如5mC和/或5hmC)保持不变；经过PCR扩增后，U转变为胸腺嘧啶(T)，甲基化的C转变为C，从而实现在单碱基水平推断每个胞嘧啶的修饰。文献报道的基于重亚硫酸盐转化的Septin9甲基化检测方法包括甲基化敏感高分辨率熔解曲线(MS-HRM)、甲基化特异性PCR联合变性高效液相色谱(MSP-DHPLC)、甲基化荧光法(Methllight法)等。MS-HRM即在用重亚硫酸盐处理待测DNA片段后进行PCR扩增，甲基化和未甲基化DNA存在序列差异，从而导致熔解温度及峰型的变化，因此，可通过熔解温度及峰型的变化区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。该方法不需要荧光探针，其直接分析引物侧翼序列的所有甲基化位点，但准确性有待提高。目前该方法在临床应用中仍缺乏大量的前瞻性研究数据的支持。MSP-DHPLC是一种甲基化特异性PCR的衍生方法，即在用重亚硫酸盐处理待测DNA片段后进行甲基化特异性PCR，扩增产物用DHPLC进行分析，该方法测试程序较易，敏感度和特异度较高。但目前该方法还处于研究阶段，需要大量的前瞻性研究数据的支持。Methllight法即在用重亚硫酸盐处理待测DNA片段后，利用特异性实时定量PCR反应进行扩增以识别完全甲基化的序列，具有敏感度高、特异性强、模板DNA用量少等特点。改良Methllight法则是在原有基础上改用水解探针并增加封闭寡核苷酸以提高分析敏感度。Methllight法是目前较为成熟的Septin9甲基化检测方法，据此方法开发的Septin9甲基化检测产品有EpigenomicsAG公司的Epitest试剂盒、AbbottMolecular的RealTimemS9试剂盒等。其中，EpigenomicsAG公司的Epitest试剂盒是首款获得FDA、CE、CFDA三方认证的用于体外定性检测人外周血血浆中Septin9基因甲基化的产品。但是，该试剂盒仅针对Septin9基因一个区域进行甲基化状态检测，且其适用的检测机型普及率较低，导致其在临床上的推广和应用受到限制。此外，值得注意的是，重亚硫酸盐转化法虽然被认为是DNA甲基化分析的“黄金标准”，但其存在两个主要缺点：1)重亚硫酸盐转化条件过于剧烈，DNA可能会降解从而降低PCR及后续分析技术的灵敏度；2)重亚硫酸盐转化将未修饰的胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶(未修饰的胞嘧啶占人类基因组中总胞嘧啶的约95％)，将所有胞嘧啶转化为胸腺嘧啶严重降低了序列复杂性，导致检测质量差，定位率低，基因组覆盖不均匀和检测成本增加等一系列问题。因此，重亚硫酸盐转化法的固有缺陷、甲基化检测的Septin9基因片段单一问题以及适用机型问题是当前Septin9基因甲基化检测中必须解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种Septin9基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒具有较高的检测通量、较高的检测特异性和敏感性。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种Septin9基因甲基化检测试剂盒，包括以下三组针对Septin9-v2外显子甲基化检测的特异性引物及探针中的至少一组，所述引物和探针为：以SEQID2为靶点的SEQIDNO.5-SEQIDNO.7、以SEQIDNO.3为靶点的SEQIDNO.8-SEQIDNO.10、以SEQIDNO.4为靶点的SEQIDNO.11-SEQIDNO.13。在其中一些实施例中，还包括TET酶和TET氧化缓冲液。在其中一些实施例中，还包括内标基因引物及探针，其碱基序列组成为SEQIDNO.14—SEQIDNO.16。在其中一些实施例中，还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品由牛血清蛋白和Septin9基因非甲基化的人基因组DNA组成；所述阳性质控品由牛血清蛋白、Septin9基因非甲基化的人基因组DNA和Septin9基因甲基化的人基因组DNA组成。在其中一些实施例中，还包括吡啶硼烷。在其中一些实施例中，所述TET氧化缓冲液配方如下：167±10mMHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液pH＝8.0，333±10mMNaCl，3.3±0.2mMα-酮戊二酸二钠盐二水合物，6.67±0.05mML-抗坏血酸，4±0.5mMATP，8.33±0.03mM二硫苏糖醇。在其中一些实施例中，所述荧光PCR预反应液包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、引物及探针、无核酸酶的水。在其中一些实施例中，所述特异性探针和内标基因探针的5’端修饰有荧光报告基团FAM、HEX、ROX或CY5，3’端连接有MGB修饰基团。本专利技术提供一种Septin9基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒设计了三组引物和探针，其来源于SEQIDNO.1Septin9-v2外显子1(包括启动子区和转录起始位点)范围内的三个区域为靶点而设计得到，具有较高的特异性。以此设计的引物和探针，再配合利用TET酶将5mC和5hmC完全氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)，随后吡啶硼烷将5caC完全还原为二氢尿嘧啶(DHU)；两者相互相成，从而实现Septin9基因甲基化的高灵敏度和高特异性的检测。本专利技术的另一个方面，是提供了一种Septin9基因甲基化检测的前处理方法，该前处理方法，适合上述Septin9基因甲基化检测的检测试剂盒的使用，能有效降低待测DNA片段的降解率，保证待测DNA片段的质量；同时，可将待测DNA样本中修饰的胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶，这就保证了序列的复杂性，结合根据此方法设计的上述引物和探针，从而提高整个检测的特异性。实现上述目的的技术方案如下。一种Septin9基因甲基化检测的样品前处理方法，包括以下步骤：(1)TET酶氧本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下三组针对Septin 9‑v2外显子甲基化检测的特异性引物和探针中的至少一组，所述引物和探针为：以SEQ ID 2为靶点的SEQ ID NO.5‑SEQ ID NO.7、以SEQ ID NO.3为靶点的SEQ ID NO.8‑SEQ ID NO.10、以SEQ ID NO.4为靶点的SEQ ID NO.11‑SEQ ID NO.13。
【技术特征摘要】
1.一种Septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下三组针对Septin9-v2外显子甲基化检测的特异性引物和探针中的至少一组，所述引物和探针为：以SEQID2为靶点的SEQIDNO.5-SEQIDNO.7、以SEQIDNO.3为靶点的SEQIDNO.8-SEQIDNO.10、以SEQIDNO.4为靶点的SEQIDNO.11-SEQIDNO.13。2.根据权利要求1所述的Septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括TET酶和TET氧化缓冲液。3.根据权利要求1所述的Septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括内标基因引物及探针，其碱基序列组成为SEQIDNO.14—SEQIDNO.16。4.根据权利要求1所述的Septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品由牛血清蛋白和Septin9基因非甲基化的人基因组DNA组成；所述阳性质控品由牛血清蛋白、Septin9基因非甲基化的人基因组DNA和Septin9基因甲基化的人基因组DNA组成。5.根据权利要求1-4任一项所述的Septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括吡啶硼烷。6.根据权利要求2-4任一项所述的Septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述TET氧化缓冲液包括以下成分：167±10mMHEPES缓冲液pH＝8.0，333±10mMNa...
【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，吴诗扬，彭璨璨，刘志明，刘芳，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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