粗裂地钱氧甲基转移酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种粗裂地钱氧甲基转移酶及其编码基因与应用。该粗裂地钱氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明专利技术提供的MpaOMT1基因是首次发现的在粗裂地钱中能够表达氧甲基转移酶的基因，其编码的氧甲基转移酶具有广谱的催化活性，能够用于制备生产甲基化的苯丙素、香豆素或黄酮等多类化合物，其中对槲皮素、杨梅素及木犀草素等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的甲基化产物，具有较高的应用价值和广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种粗裂地钱氧甲基转移酶及其编码基因与应用。
技术介绍
植物体内含有丰富的次生代谢产物，例如黄酮、苯丙素、香豆素和萜类等。这些化合物在植物体内参与生长发育过程、响应生物和非生物胁迫、氧化应激的调节及植物激素的调节等。在适应从水生到陆生的环境变化过程中，苔类植物积累了各种类型的化合物，许多新骨架成分及新药也从苔类植物中被发现。次生代谢产物的后修饰需要氧甲基转移酶的参与，以生成多种苯环上含氧甲基的产物，改变了含芳香类化合物的生理特性和化学活性，扩大了代谢产物的多样性，对于开发植物源药用成分意义重大。目前已研究的氧甲基转移酶多数来源于含有维管组织的高等植物，而苔藓植物中的氧甲基转移酶极少被鉴定。粗裂地钱(Marchantiapaleacea)为地钱科(Macrhantineae)一种苔类植物的叶状体，属于苔藓植物中的一种，广泛分布于各地，多生于阴暗潮湿的地方。我国苔藓植物资源十分丰富，已报道的约有3000多种。但目前对于粗裂地钱这一植物资源的研究还相对较少，已有的研究多集中于粗裂地钱中化学成分的分离纯化，而从粗裂地钱中分离鉴定出具有广谱催化活性的氧甲基转移酶还未见报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一个来源于粗裂地钱的氧甲基转移酶及其编码基因与应用。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术提供的一种粗裂地钱氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。上述粗裂地钱氧甲基转移酶的编码基因也属于本专利技术的保护范围。上述编码基因(MpaOMT1)中，其核苷酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(2)与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。进一步的，本专利技术还提供了含有上述编码基因的表达载体。上述表达载体为重组原核表达载体或重组植物表达载体。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述重组原核表达载体为：在表达载体pET32a中插入上述编码基因。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述重组植物表达载体为：在表达载体pGWB5中插入上述编码基因。本专利技术还提供了含有上述表达载体的重组细胞、转化体。优选的，所述重组细胞为含有上述表达载体的细胞BL21(DE3)或细胞EHA105。本专利技术还提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。上述粗裂地钱氧甲基转移酶在制备生产甲基化的苯丙素、香豆素或黄酮类化合物中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的MpaOMT1基因是首次发现的在粗裂地钱中能够表达氧甲基转移酶的基因，本专利技术利用PCR技术从cDNA获得了其全长序列，通过构建GFP定位载体，用烟草瞬时转化法发现该基因定位于细胞质和细胞核。构建该基因的原核表达载体，IPTG诱导蛋白表达。结果发现其编码的氧甲基转移酶具有广谱的催化活性，能够用于制备生产甲基化的苯丙素、香豆素或黄酮等多类化合物，其中对槲皮素、杨梅素及木犀草素等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的甲基化产物，具有较高的应用价值和广阔的应用前景。附图说明图1：表达基因MpaOMT1扩增产物电泳图，其中，A：从cDNA中扩增MpaOMT1全长结果，B：MpaOMT1ORF扩增结果。图2：MpaOMT1蛋白SDS-PAGE电泳图；其中：泳道1：MpaOMT1的上清液；泳道2：MpaOMT1的沉淀；泳道3：MpaOMT1的纯化蛋白。图3：咖啡酰辅酶A、辅酶A、咖啡酸紫外吸收示意图。图4：MpaOMT1的底物及反应产物。图5：MpaOMT1的亚细胞定位。具体实施方式结合实施例对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1.表达基因MpaOMT1的克隆1.1CTAB-PVP法提取粗裂地钱总RNA(1)取新鲜粗裂地钱植物材料，洗净后用滤纸吸干多余水分。加液氮研磨材料，反复2-3次至材料成粉末状，取少量至提前预冷的离心管中。(2)加1ml65℃预热的CTAB-PVP提取液，振荡缓和均匀。上述CTAB-PVP提取缓冲液配制方法：100mMTris·HCl(pH8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mMEDTA，2MNaCl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；以上溶液用DEPC处理过的ddH2O配制，高压灭菌后备用。(3)65℃温浴30min，期间每隔6-10min振荡一下。(4)冷却后加入600μl氯仿，振荡混合均匀。(5)4℃13,000rpm离心10min。(6)取上清转移至新离心管，加入600μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。(7)重复上步(即用氯仿抽提三次)。(8)小心吸取上清转移至新的1.5ml离心管中，加入1/3体积的8MLiCl，-20℃静置3h以上(或4℃静置过夜)。(9)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。(10)加入800μl75％乙醇洗涤沉淀。离心弃上清后挥干剩余乙醇。(11)加入40μlProteinaseK处理后的灭菌水溶解RNA，制得总RNA。使用BioPhotometerplus核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度及质量。1.2cDNA的合成以提取的粗裂地钱的总RNA为模板，以PrimeScriptRTMasterMix逆转录体系通过PCR技术获得cDNA模板链。将下列各组分加入进口PCR管中，轻轻混匀，离心，使混合液集中于PCR管底部。在PCR仪中逆转录程序如下：37℃,15min；85℃,15s；4℃保温。逆转录产物保存于-20℃，使用前稀释10倍。1.3MpaOMT1全长基因的克隆以稀释的粗裂地钱cDNA为模板，以MpaOMT1F1/R1为引物，采用PrimeSTARDNApolymerase体系扩增MpaOMT1目的片段。MpaOMT1F1：GCAAGCAGCAGCAGCATAT；(SEQIDNo.3)MpaOMT1R1：TTTCTCACCAACCTCGGAC；(SEQIDNo.4)体系如下：将以上组分加入进口PCR管混合均匀后，低转速离心，按照以下程序扩增：①94℃，3min；②94℃，10S；③52℃，15S；④72℃，30S；⑤Goto②，33times；⑥72℃，10min。PCR结果同样进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1-A)，将目的条带切胶回收，方法如下。将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％，W/V)，并用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：(1)电泳结束后溴化乙锭(Ethidiumbromide,EB)染色5min，于紫外灯下快速切下含有目的条带的胶块，将胶块放入1.5mL离心管。(2)加入500μLBindingBuffer(XP2)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粗裂地钱氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种粗裂地钱氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。2.权利要求1所述粗裂地钱氧甲基转移酶的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(2)与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达载体。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组原核表达载体或重组植物表达载体。6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：程爱霞，许瑞雪，刘慧，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37