山楂果实矢车菊素-3-羟基糖基转移酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了山楂果实矢车菊素-3-羟基糖基转移酶及其编码基因与应用。本发明专利技术提供了一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。本发明专利技术首次从山楂果实中克隆得到山楂果实矢车菊素-3-O-半乳糖苷转移酶(Cp3OGT)基因，体外实验表明，Cp3OGT具有催化矢车菊素和UDP-D-半乳糖生成矢车菊素-3-O-半乳糖苷的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及山楂果实矢车菊素-3-羟基糖基转移酶及其编码基因与应用。
技术介绍
花色苷属于黄酮类物质，是广泛分布于自然界的一种水溶性植物色素，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、防治心血管疾病等多种生物活性。前期研究表明，山楂果实中花色苷类成分主要为矢车菊素3-O-β-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-α-阿拉伯糖苷两种花色苷，并通过化学分离的手段分离得到其单体化合物。由于花色苷的不稳定性，给化学分离造成了困难，导致花色苷标准品市场售价极高；有些种类的花色苷由于在植物中含量极低，无法通过化学分离的手段得到。生物合成技术为大量获得有效成分提供了新的思路，近年来，有关花色苷生物合成与调控机制的研究已在玉米、拟南芥、葡萄、苹果等植物中取得了进展。矢车菊素-3-O-半乳糖苷转移酶催化矢车菊素与UDP-D-半乳糖生成矢车菊素-3-O-半乳糖苷，是矢车菊素-3-O-半乳糖苷生物合成下游的关键酶。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供山楂果实矢车菊素-3-羟基糖基转移酶及其编码基因。本专利技术提供的蛋白，命名为Cp3OGT，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白质的DNA分子也是本专利技术保护的范围。上述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)编码区为序列表中序列1第27-1475位所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术保护的范围。重组载体为将序列表中序列1所示的Cp3OGT基因插入pET28a载体的BamHI酶切位点间得到的载体，命名为pET28a-Cp3OGT。扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本专利技术保护的范围。引物对为上游引物P3:5’GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCACCGCCGCAGCCCACCG3’(序列3)和下游引物P4:5’TGTCGACGGAGCTCGAATTCCTATGCTTTATTGGATCCTGAT3’(序列4)。上述蛋白在作为矢车菊素-3-羟基糖基转移酶中的应用也是本专利技术保护的范围。上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备矢车菊素-3-羟基糖基转移酶中的应用也是本专利技术保护的范围。上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化矢车菊素与UDP-D-半乳糖生成矢车菊素-3-O-半乳糖苷中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术另一个目的是提供一种制备矢车菊素-3-羟基糖基转移酶的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：培养上述重组菌，收集培养物，得到矢车菊素-3-羟基糖基转移酶。本专利技术的实验证明，本专利技术首次从山楂果实中克隆得到山楂果实矢车菊素-3-O-半乳糖苷转移酶(Cp3OGT)基因，体外实验表明，Cp3OGT具有催化矢车菊素和UDP-D-半乳糖生成矢车菊素-3-O-半乳糖苷的活性。利用本专利技术可以通过基因工程技术来提高山楂等植物中矢车菊素-3-O-半乳糖苷等花色苷类成分的含量，或通过生物合成技术制备矢车菊素-3-O-半乳糖苷等花色苷类成分。附图说明图1为重组表达载体pET28a-Cp3OGT的图谱。图2为Cp3OGT蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下的实施例便于更好的理解本专利技术，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。在下述实施例中使用的试验方法中，未注明具体条件的实验方法，均为本领域技术人员的公知常识，各种缓冲溶液，检测试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得或者由常规实验方法制备获得。试验中使用试剂如同源重组克隆试剂盒(pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit)、蛋白Marker、大肠杆菌感受态TransT1和BL21DE3、pET28a载体以及DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，RNA反转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司公司，BamHI限制性内切酶购自纽英伦(NEB)生物技术北京有限公司，其他常用试剂购自宝生物(大连)工程有限公司(TaKaRa)公司。引物合成和测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。下面通过实例进一步详细描述本专利技术。实施例1、矢车菊素-3-O-半乳糖苷转移酶基因Cp3OGT的克隆利用改良CTAB法分别提取山楂果实的总RNA，反转录得到cDNA为模板，用正向引物P1:5’ATGGCACCGCCGCAGCCCACCG3’，反向引物P2:5’CTATGCTTTATTGGATCCTGAT3’进行PCR扩增，得到的1.4kbPCR产物。上述扩增体系(10μL)如下：5×PSGXLBuffer2μL，dNTPs(2.5mmol·L-1)0.8μL，引物P1和P2各0.2μL，PrimeSTARGXL0.2μL，模板1μL，其余用无菌双蒸水补足。反应条件：98℃预变性3min；98℃10s，55℃退火15s，68℃延伸1min30s，40个循环；68℃延伸5min，4℃保存。经过测序，1.4kbPCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，开放阅读框为序列1第27-1475位核苷酸所示的基因命名为Cp3OGT，编码的蛋白命名为Cp3OGT，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。实施例2、矢车菊素-3-O-半乳糖苷转移酶基因Cp3OGT的功能研究1、重组载体的制备提取山楂果实的总RNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或
缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-4)中
任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列1第27-1475位所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的
DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至
少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有
98％或...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，唐金富，杨滨，闫述模，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11