本发明专利技术涉及一种苦豆子肌醇甲基转移酶及其编码基因及应用，属于基因工程技术领域。苦豆子肌醇甲基转移酶基因的名称为SaIMT，大小为1095bp，编码364个氨基酸，利用盐(NaCl)胁迫条件下构建的苦豆子根的cDNA酵母表达文库，从中筛选出于盐胁迫相关的基因序列SaIMT；SaIMT的生物信息学分析表明，SaIMT与其他物种的IMTs蛋白具有有较高的同源性和较近的亲缘关系，同时SaIMT与大豆GmIMT，蛋白序列结构域上均很保守，而二者的蛋白质三级结构都非常相似，表明SaIMT与其同源基因有着相似的功能；实时荧光定量PCR结果表明SaIMT基因在盐胁迫初期表达量有明显的升高；转SaIMT的大豆发状根和大豆发状根植物复合体的耐盐性均明显提高，说明SaIMT能提高转基因植物的耐盐性，对丰富抗性基因资源及培育耐盐大豆品种具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及苦豆子肌醇甲基转移酶及其基因CDS序列及应用。
技术介绍
土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有20％的耕地受到盐害威胁，43％的耕地为干旱、半干旱地区。盐害严重影响植物的生长发育，造成作物减产，并使生态环境日益恶化。在自然条件下，由于环境胁迫而严重影响了作物生长发育，其遗传潜力难以发挥，盐渍不仅影响了作物的产量，而且限制了植物的广泛分布，因此，提高作物的耐盐能力已成为抗逆育种急需解决的关键问题之一。随着分子生物学的发展和转基因技术的成熟，利用转基因技术提高植物的耐盐碱性，已在盐碱土壤改良方面得到广泛的应用。同时，以旱生、耐盐碱植物为研究材料，从中分离克隆得到耐盐碱性显著的基因，是获得抗性基因资源的有效方法。苦豆子(Sophora alopecuroides.L)为豆科槐属植物，别名、苦豆草、欧苦参等，为多年生草本、根茎地下芽旱生耐盐植物。其耐旱、耐盐性显著，是一个抗性基因丰富的基因资源库。因此，从苦豆子中筛选克隆盐胁迫相关基因，分析其耐盐性，阐明其相关功能，有助于对抗盐基因的进一步利用。松醇(O-甲基肌醇)是肌醇的甲基衍生物，是一种多元醇，它是由肌醇甲基转移酶(IMT)催化合成的。松醇在植物细胞内的积累与植物对干旱、盐胁迫的耐受性密切相关。在许多物种中，包括细菌、酵母、藻类和动物也有观察到了类似的胁迫耐受现象。植物在盐胁迫条件下会大量产生并积累这些化合物，这些代谢产物作为渗透调节物质发挥作用，通过降低渗透势来增加植物的保水能力。有些代谢产生多元醇还能作为活性氧清除剂，能够清除对毒性极强的羟基自由基。而它们的另一个重要功能是在水分胁迫下保持蛋白质的水合，保证代细胞谢的正常进行。醇经由一下四个步骤合成。在L-肌醇1-磷酸合酶(MIPS)催化葡萄糖-6-磷酸合成肌醇，该酶由INO1基因负责编码[98]。经MIPS催化合成的肌醇再由Mg2+依赖的L-肌醇1-磷酸化酶催化形成自由肌醇。在盐胁迫条件下，自由肌醇再由肌醇甲基转移酶(IMT)甲基化，进而合成肌醇甲酯，肌醇甲酯再被肌醇甲酯异构酶差向异构化，最
终合成渗透调节有机物松醇。在IMT的催化过程依赖于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM与甲基的循环密切相关。目前合成肌醇甲基转移酶的IMT1基因已经从多种植物中克隆得到，包括拟南芥、野生水稻(Porteresia coarctata)、大豆、芝麻(Sesamum indicum)和盐生植物冰叶菊(Mesembryanthemum crystallinum)在松醇合成的整个途径当中，IMT是其中的关键酶，肌醇是最重要的底物。研究发现，野生水稻中由PcINO1基因编码的MIPs蛋白具有特殊的功能，该酶即使在高盐胁迫下仍然保持很强的活性，保证了在盐害情况下底物肌醇的充足供应。同时在盐胁迫条件下，IMT的合成也相应增加，肌醇大量转化为松醇。
技术实现思路
本专利技术提供一种苦豆子肌醇甲基转移酶及其编码基因及应用，能提高植物耐盐性。本专利技术苦豆子肌醇甲基转移酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。本专利技术编码苦豆子肌醇甲基转移酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。本专利技术所述苦豆子肌醇甲基转移酶在提高植物耐盐性中的应用。我们利用苦豆子cDNA酵母表达文库对苦豆子抗盐相关基因进行筛选，得到了一盐胁迫相关基因，肌醇甲基转移酶基因，命名为SaIMT。在苦豆子中，到目前为止，关于SaIMT的作用还未见报道。利用任何一种能够引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的SaIMT编码基因导入植物细胞，可获得耐盐性提高的转基因细胞系及转基因植株。使用本专利技术的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。携带有本专利技术SaIMT的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本专利技术的基因对提高植物耐盐性，提别是培育耐盐大豆品种具有重要意义。附图说明图1是SD/-Ura(含NaCl 0.68mol/l)筛选培养基菌落图；图2是酵母阳性克隆PCR检测图，M:2000bp marker,1-10:酵母扩增结果；图3是SaIMT基因在苦豆子不同组织中的表达结果图；图4是SaIMT基因在NaCl胁迫下的表达结果图，内参基因为Sophora alopecuroides lectin(Gen Bank检索号：DQ011517.1)；数据为三次重复实验的mean±SD；图5是SaIMT基因的农杆菌菌液PCR结果，M：2000bpmarker，1-6：SaIMT基因；图6是大豆发状根的诱导及GUS检测图，其中A：阴性对照，B：转基因大豆发状根的GUS染色；图7是转基因大豆发状根中SaIMT基因的qRP-PCR检测图；1,2,3为3次重复，PCHF-1301为阴性对照；图8是带子叶转基因大豆发状根耐盐表型图；图9是带子叶转基因大豆发状根在不同浓度NaCl胁迫下发状根的干重比较图，*表示达到0.05概率显著水平；图10是离体转基因大豆发状根耐盐表型图；左边：对照(空载),右边：转基因发状根；图11是离体转基因大豆发状根在不同浓度NaCl胁迫下的湿重比较图，*表示达到0.05概率显著水平**表示达到0.01概率极显著水平；图12是离体转基因大豆发状根在不同浓度NaCl胁迫下的存活数比较图，*表示达到0.05概率显著水平；图13是转SaIIMT基因大豆发状根复合体植株的耐盐表型图；图14是转SaIMT基因大豆发状根复合体植株在不同浓度NaCl胁迫下发状根的湿重比较，*表示达到0.05概率显著水平。具体实施方式实施例1、苦豆子SaIMT基因的筛选与克隆选取籽粒饱满的苦豆子种子10g，加入5ml浓度98％的浓硫酸浸泡处理20min。洗净种子后播种于花土中盆栽。培养条件为：16h光照，温度26℃，湿度65％，光强30000勒克斯。萌发四周后，分别将幼苗转移至NaCl浓度为200mmol、Na2CO3浓度为140mmol和PEG6000浓度为8％的hoagland营养液中分别处理3h，12h，24h，72h。取各处理下的苦豆子根部，分别提取不同处理条件下苦豆子根的totalRNA。取上述提取的4个处理的苦豆子根部RNA，等质量混合各组样品用于cDNA文库构建。提取构建完成的cDNA文库质粒，将文库质粒大规模转化酿酒酵母INVSC1感受态细胞构
建苦豆子苗期酵母表达cDNA文库。利用酵母植物抗逆基因筛选体系筛选苦豆子抗盐相关基因，筛选方法如下：取适量文库菌液(使克隆总数达文库滴度的5-10倍)，涂布SD/-Ura(含NaCl0.68mol/l)筛选平板，30℃倒置培养2-4天至菌落出现，如图1所示；保存筛选到的酵母菌株，根据酵母表达载体序列设计引物，引物为：按照表1反应和表2程序进行PCR检测：表1 PCR反应体系本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苦豆子肌醇甲基转移酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.2。
【技术特征摘要】
1.一种苦豆子肌醇甲基转移酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.2。2.一种编码苦豆子肌醇甲基转移酶的基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆钰，郭文云，刘雅婧，王英，李景文，闫帆，赵明珠，尹智超，王天亮，申梓邑，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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