与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其应用，本发明专利技术根据TH基因SNP位点rs10770140多态性与阿片类物质依赖(OD)的相关性，设计了用于扩增TH基因多态性位点所在序列片段的特异引物，并提供了包含该引物的SNP分型检测试剂盒及分型检测方法。本发明专利技术能够对rs10770140位点进行基因分型，方法简便、快速，结果准确、明了，为OD易感性鉴定提供了一个新的途径。

Detection of SNP locus of th gene related to opioid dependence and its application

【技术实现步骤摘要】
与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其应用
本专利技术属于基因检测与分析领域，涉及与阿片类物质依赖(opioidsdependence，OD)易感性相关的酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点rs10770140的分型检测及其应用。
技术介绍
药物依赖是一种以强迫觅药及对药物持续渴求为特点的慢性复发性脑疾病，对个人和社会造成严重危害。阿片类物质是从罂粟植物中提取的生物碱及衍生物，其中，吗啡是目前临床上最有效的镇痛药，临床中晚期癌症患者使用吗啡镇痛的人数每年以1300万左右的数量增长，但因其显著依赖性和耐受性，临床应用受到诸多限制，而阿片类处方药也成为非医疗性药物滥用的首要目标，最近三年美国正遭受日益严重的阿片药物滥用危机。因此，鉴别阿片类物质依赖的易感人群对于临床阿片类镇痛药合理使用具有非常重要的意义。关于药物依赖的脑神经生物学机制目前尚不十分清楚，但有大量证据证实阿片类药物依赖存在显著的遗传因素，是基因遗传易感性与环境影响共同作用的结果。近年来，关于基因多态性在药物依赖中的作用受到越来越多的关注。基因多态性是指同一种群内个体与个体间基因核苷酸序列存在的差异性，即在一个随机婚配的生物群体中染色体同一基因位点上存在两种以上不连续的基因型，基因多态性所致编码的相应氨基酸改变可决定个体对疾病的易感性及表型差异。阿片类物质依赖的产生与脑内多巴胺奖赏系统密切相关，而单胺能神经递质系统的相关基因对奖赏系统具有重要的调控作用，故这类基因成为研究阿片类物质依赖的重要候选基因。酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)是多巴胺及其他儿茶酚胺类神经递质合成的起始酶及限速酶，决定着多巴胺以及儿茶酚胺合成的速率，在哺乳类动物中枢神经系统及周围神经系统中发挥着重要作用。现阶段有关TH基因在神经系统上的研究主要集中于高血压、帕金森、躁郁症以及精神分裂症的形成机制上，而关于TH基因与药物依赖特别是阿片类物质依赖的相关研究却鲜有报道。迄今，随着高通量、高精准度DNA研究技术的不断发展，与药物成瘾相关的分子遗传机制研究也快速发展，不断有研究报道新的候选基因；目前对TH基因内rs10770140位点的多态性的研究只见于高血压形成机制的相关报道中，而rs10770140位点与阿片类物质依赖的关系目前尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，包括以下步骤：以待测个体(例如，受试人)基因组DNA为模板，PCR扩增TH基因片段，对扩增得到的片段进行测序，根据测序结果确定TH基因SNP位点rs10770140的等位基因类型或基因型。优选的，所述基因组DNA提取自体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝脏组织、皮肤组织、肌肉组织)、毛发等生物样品。优选的，所述TH基因片段位于人类基因组chr11.2172249-2172504，序列中第119位为SNP位点rs10770140的对应碱基位置。本专利技术通过dbSNP数据库与基因组比对，发现TH基因rs10770140位点两端突变较多，其引物设计难度较大。因此本专利技术在rs10770140位点两端选定区域，根据该区域设计了特异性核酸引物，增加了扩增产物的准确性，可更好的扩增不同受试人的SNP位点rs10770140。优选的，通过前期的多次实验，确认了扩增效果最佳的含有兼并碱基的引物，其中，上游引物如SEQ.ID.NO.2所示，下游引物如SEQ.ID.NO.3所示。优选的，所述PCR的反应体系包括10μM上、下游引物各1μL，以及50ng/μL模板DNA1μL。优选的，所述PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸1min，共45个循环；72℃延伸5min。优选的，所述测序采用TA克隆测序法。PCR为体外扩增，碱基突变机率非常大，TA克隆后的质粒转入大肠杆菌中，利用菌体自身的修复机制可以保证克隆的单一性，利于筛选需要的序列。优选的，所述SNP位点rs10770140的等位基因为T和C。上述与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法在治疗疼痛的新药开发中的应用。上述与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点rs10770140在制备用于筛查阿片类物质(例如，吗啡)依赖易感性的试剂盒以及在制备阿片类物质依赖的早期诊断试剂盒、基因治疗试剂盒中的应用。一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的基因分型检测试剂盒，该试剂盒包括用于扩增包含TH基因SNP位点rs10770140的序列片段(例如，以上位于人类基因组chr11.2172249-2172504的片段)的引物对(例如，SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的引物)。优选的，所述试剂盒还包括用于对扩增产物进行TA克隆测序的试剂。优选的，提取受试人基因组DNA并通过测序获得SNP位点rs10770140的基因型，所述基因型为C/C的个体具有明显的阿片类物质依赖易感性，基因型为T/T的个体不具有阿片类物质依赖易感性。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术根据酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)基因SNP位点rs10770140多态性与阿片类物质依赖的相关性，结合PCR扩增及TA克隆测序技术，提供可检测该TH基因SNP多态性位点的分型试剂盒及分型检测方法，能够对rs10770140位点进行简便、快速的基因分型，分型结果准确、明了，为OD易感性鉴定提供了一个新的途径，应用前景广泛。附图说明图1为不同受试者扩增产物电泳图谱：参照左侧Marker(125bp、250bp、375bp、500bp、750bp、1000bp、1250bp、2000bp)泳道，扩增产物大约为270bp。图2A为受试者测序结果图：T/T型。图2B为受试者测序结果图：C/T型。图2C为受试者测序结果图：C/C型。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步描述，所述实施例是对本专利技术的解释，而非对本专利技术保护范围的限制。本专利技术对SNP位点rs10770140的序列进行研究，通过提取人基因组DNA，测定受试者TH基因rs10770140多态位点的基因型，发现该多态位点与受试者对OD易感性密切相关：TH基因rs10770140多态位点的基因型为C/C纯合子时，受试者的易感性最高；TH基因rs10770140多态位点的基因型为C/T杂合子时，受试者的易感性较高；TH基因rs10770140多态位点的基因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最低。基于以上发现，本专利技术提出一种阿片类物质依赖(OD)易感性相关的OD高危人群筛查方法及筛查试剂盒。(一)血液样本收集和基因组DNA的提取本专利技术实验组包括了中国西安精神卫生中心美沙酮维持治疗计划中登记的556名非相关阿片类药物(例如，吗啡等)成瘾者，对照组由600名从未被诊断出药物滥用和精神疾病的无关健康人士(健康对照)组成。所有受试者均为汉族，签署知情同意书，并采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测个体基因组DNA为模板，PCR扩增TH基因部分片段，对扩增得到的片段进行测序，根据测序结果确定个体TH基因SNP位点rs10770140的等位基因类型或基因型。

【技术特征摘要】
1.一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测个体基因组DNA为模板，PCR扩增TH基因部分片段，对扩增得到的片段进行测序，根据测序结果确定个体TH基因SNP位点rs10770140的等位基因类型或基因型。2.根据权利要求1所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：所述TH基因部分片段对应于参考基因组序列chr11.2172249-2172504。3.根据权利要求1所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的扩增引物如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。4.根据权利要求1所述一种与阿片类物质依赖相关的TH基因SNP位点的检测方法，其特征在于：所述测序采用TA克隆测序法。5.一种如权利要求1所述的检测方法在治疗疼痛的新药开发中的应用。6.一种TH基因SNP位点在制备用于筛查阿片类物质依赖易感...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎春霞，李少卿，张宝，朱峰，杨婧思，刘军林，张玉向，吴亚楠，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61