用于检测外泌体中核酸表达水平的内参基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了内参基因在制备用于检测目的基因在外泌体中的表达水平的试剂或试剂盒中的应用，以及一种内参基因组合和该内参基因组合在制备用于检测目的基因在外泌体中的表达水平的试剂中的应用。本发明专利技术还提供了一种试剂组合，以及一种检测目的基因在外泌体中表达水平的方法。与外源参照基因相比，利用本发明专利技术的内参基因组合所获得的检测结果准确度更高。

Internal reference gene used to detect the level of nucleic acid expression in exosomes and its application

【技术实现步骤摘要】
用于检测外泌体中核酸表达水平的内参基因及其应用
本专利技术属于生物
具体地，本专利技术涉及内参基因及其应用。更具体地，涉及用于检测外泌体中核酸表达水平的内参基因及其应用。
技术介绍
基因表达在生命科学领域有广泛的应用。基因表达量检测对基因功能解析和寻找与特定表型和疾病相关基因具有重大意义，找到影响功能基因表达量的因素对解析相关疾病的成因和寻找适合的治疗方法具有重要的指导作用。应用较为广泛的基因表达量检测方法包括实时荧光定量PCR(Quantitativereal-timeRT-PCR，qRT-PCR)、RNA印迹(Northernblotting)、核糖核酸酶保护分析(ribonucleaseprotectionassay，RPA)、基因芯片(genechip)等。为获得更加准确可信的结果，需要内参基因对目的基因的表达水平进行标准化衡量。聚合酶链式反应技术(简称PCR技术)具有耗时短、特异强、灵敏高等特点，被广泛应用于基因表达的定量分析。PCR技术的灵敏度高，但容易出现假阳性、假阴性的检测结果。内参基因作为PCR反应的内部参照，具有校准样品量和反转录效率的作用，可以提高试验数据的准确性。理想的内参基因在样本中表达稳定。因此，利用PCR对目的基因进行相对定量的准确性依赖于内参基因。细胞外囊泡中最重要的一种囊泡叫做外泌体。外泌体(Exosome)是一类直径30-150nm，具有完整膜结构的细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。外泌体在1983年被发现，1987年正式被定名为exosome，最早被认为是细胞的废弃物。后来的研究表明，外泌体中包裹有细胞特异的核酸、蛋白与脂类，并能作为信号分子向其他细胞传递信息。更进一步的研究发现，外泌体在很多生理病理过程中扮演着重要的角色，如免疫中的抗原呈递，肿瘤的生长与迁移等。外泌体中核酸表达谱是目前研究的热点领域。外泌体核酸的差异表达往往指示着细胞不同的生理状态，不仅能为临床诊断提供有效的标志物，同时能够从机制上解释肿瘤等疾病的进展过程。荧光PCR技术是鉴定核酸差异表达的一种重要方法。将核酸反转录后得到的cDNA加入到PCR反应体系中，通过比较目的基因CT值与内参基因CT值的差异，从而对待检测的目的基因进行相对定量，来了解该目的基因的表达情况。然而，相比于组织或者细胞的核酸，外泌体中核酸的丰度非常低，往往都不会高于10ng。由于外泌体中核酸含量过低，导致在荧光PCR检测目的基因在外泌体中的表达时，经常出现数据重复性不佳等情况，其中的一个重要原因就是目前外泌体核酸研究中，没有稳定的内参来校准目的基因的表达。因此，目前对于用于检测基因在外泌体中表达水平的稳定的内参基因或内参基因组合仍存在迫切需求。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术人通过大量研究实验，发现了一组稳定的内参基因，由该内参基因构成的内参基因组合可以用于检测目的基因在外泌体中的核酸表达水平。此外，本专利技术人通过进一步对内参基因的外显子进行优选，发现了可以更准确地检测目的基因在外泌体中相对表达量的内参基因外显子。因此，本专利技术的目的之一在于提供在外泌体中稳定表达的内参基因外显子。本专利技术的目的还在于提供一种内参基因组合，所述内参基因组合包括基因ACTB、EEF2、MSN和TLN1。另外，本专利技术的目的还在于提供上述内参基因和内参基因组合在检测目的基因在外泌体中的表达水平中的应用。一方面，本专利技术提供内参基因在制备用于检测目的基因在外泌体中的表达水平的试剂或试剂盒中的应用，其中，所述内参基因选自ACTB基因的6号外显子、EEF2基因的15号外显子、MSN基因的4号外显子或TLN1基因的57号外显子。另一方面，本专利技术提供一种内参基因组合，其中，所述内参基因组合包括ACTB、EEF2、MSN和TLN1基因。在一个具体实施方案中，ACTB基因选自其1、2、3、4、5和6号外显子，更优选选自其4、5和6号外显子，特别优选其6号外显子。在一个具体实施方案中，EEF2基因选自其1、2、12、13、14和15号外显子，更优选选自其1、12和15号外显子，特别优选其15号外显子。在一个具体实施方案中，MSN基因选自其1、2、3、4、12和13号外显子，更优选选自其1、4号和12号外显子，特别优选其4号外显子。在一个具体实施方案中，TLN1基因选自1、2、3、27、56和57号外显子，更优选选自其1、27号和57号外显子，特别优选其57号外显子。在一个具体实施方案中，内参基因组合用于检测目的基因在外泌体中的表达水平。另一方面，本专利技术提供如上所述的内参基因组合在制备用于检测目的基因在外泌体中的表达水平的试剂中的应用。另一方面，本专利技术提供一种试剂组合，包括特异性扩增上述内参基因组合中各基因的引物对1～4，其中，引物对1用于扩增ACTB基因，引物对2用于扩增EEF2基因，引物对3用于扩增MSN基因，引物对4用于扩增TLN1基因。在一个具体实施方案中，引物对由上游引物和下游引物组成。在一个具体实施方案中，引物对1的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，引物对2的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，引物对3的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，引物对4的核苷酸序列如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示。在一个具体实施方案中，试剂组合还包括探针。在一个具体实施方案中，试剂组合是用于检测目的基因在外泌体中表达水平的试剂盒。另一方面，本专利技术提供一种检测目的基因在外泌体中表达水平的方法，包括：1)利用上述试剂组合，获得内参基因的CT值，所述内参基因包括ACTB、EEF2、MSN和TLN1；2)将内参基因的CT值带入公式模型，获得CONCT值，所述公式模型为：CONCT＝0.7×ACTBCT+0.1×EEF2CT+0.1×MSNCT+0.1×TLN1CT，其中，ACTBCT代表ACTB的CT值，EEF2CT代表EEF2的CT值，MSNCT代表MSN的CT值，TLN1CT代表TLN1的CT值；3)获得目的基因的CT值；4)用3)中获得的目的基因的CT值减去2)中获得的CONCT值，得到△CT值，获得目的基因在外泌体中的表达水平。在一个具体实施方案中，表达水平是相对表达量。本专利技术的内参基因组合中的基因表达稳定性高，重复性强，具有广泛的适用性。利用本专利技术的内参基因组合，通过进一步对外显子进行优选，可以准确地检测目的基因在外泌体中的相对表达量。与外源参照基因(spiked-incontrol)相比，利用本专利技术的内参基因组合所获得的检测结果准确度更高。本专利技术的方法提高了PCR检测的检测效率，并提高了检测结果的可信度。此外，本专利技术人所设计的引物特异性强，提高了扩增效果以及检测效率，获得的检测结果具有高可信度。附图说明图1为PCR反应程序参数。图2为ACTB基因的1、2、3、4、5和6号外显子的CT值。图3为EEF2基因的1、2、12、13、14和15号外显子的CT值。图4为MSN基因的1、2、3、4、12和13号外显子的CT值。图5为TLN1基因的1、2、3、27、56和57号外显子的CT值。图6为10例入组样本在三组不同外显子组合(组合1、组合2和组合3)下的CONCT值。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.内参基因在制备用于检测目的基因在外泌体中的表达水平的试剂或试剂盒中的应用，其中，所述内参基因选自ACTB基因的6号外显子、EEF2基因的15号外显子、MSN基因的4号外显子或TLN1基因的57号外显子。

【技术特征摘要】
1.内参基因在制备用于检测目的基因在外泌体中的表达水平的试剂或试剂盒中的应用，其中，所述内参基因选自ACTB基因的6号外显子、EEF2基因的15号外显子、MSN基因的4号外显子或TLN1基因的57号外显子。2.一种内参基因组合，其中，所述内参基因组合包括ACTB、EEF2、MSN和TLN1基因。3.根据权利要求2所述的内参基因组合，其中，所述ACTB基因选自其1、2、3、4、5和6号外显子；所述EEF2基因选自其1、2、12、13、14和15号外显子；所述MSN基因选自其1、2、3、4、12和13号外显子；所述TLN1基因选自1、2、3、27、56和57号外显子。4.根据权利要求2所述的内参基因组合，其中，所述ACTB基因选自其4、5和6号外显子；所述EEF2基因选自其1、12和15号外显子；所述MSN基因选自其1、4号和12号外显子；所述TLN1基因选自其1、27号和57号外显子。5.根据权利要求1所述的内参基因组合，其中，所述ACTB基因选自其6号外显子；所述EEF2基因选自其15号外显子；所述MSN基因选自其4号外显子；所述TLN1基因选自其57号外显子。6.根据权利要求2～5中任一项所述的内参基因组合，其中，所述内参基因组合用于检测目的基因在外泌体中的表达水平。7.权利要求2～5中任一项所述的内参基因组合在制备用于检测目的基因在外泌体中的表达水平的试剂中的应用。8.一种试剂组合，包括特异性扩增权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩君，
申请(专利权)人：宽盈医疗科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31