一种检测牛流行热病毒的引物及检测试剂盒制造技术

技术编号:15888311 阅读:121 留言:0更新日期:2017-07-28 16:22
本发明专利技术公开一种用于检测牛流行热病毒的引物,以及由这些引物构成的可检测检测牛流行热病毒试剂盒。本发明专利技术的一种检测牛流行热病毒引物为:SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。本发明专利技术的检测牛流行热病毒的试剂盒内包括前述四条引物。本发明专利技术的引物可以与已经报道的牛流行热病毒G基因有较好的匹配,本发明专利技术的检测试剂盒可更有利于用于检测牛流行热病毒。

Primer for detecting bovine epidemic fever virus and detection kit

The invention discloses a primer for detecting bovine ephemeral fever virus, and a kit for detecting bovine epidemic fever virus which is constituted by these primers. A detection of bovine ephemeral fever virus primer of the invention is: SEQ No.1, SEQ ID ID No.2, SEQ No.3, SEQ ID ID No.4. In the kit for detecting bovine epidemic fever virus, the present invention comprises four primers. The primers of the invention can match the G gene of the bovine epidemic fever virus which has been reported, and the detection kit of the invention can be more favorable for detecting bovine epidemic fever virus.

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛流行热病毒的引物及检测试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测牛流行热病毒的引物,以及由这些引物构成的可检测检测牛流行热病毒试剂盒。
技术介绍
牛流行热(bovineephemeralfever,BEF)是由牛流行热病毒(bovineephemeralfevervirus,BEFV)引起的黄牛、奶牛、肉牛及水牛的一种急性非接触性传染病。BEFV由媒介昆虫蚊子和库蠓传播,其流行具有明显的季节性,常发生在夏末秋初,有一定的周期性。BEF传播迅速,流行面广,在埃及、赞比亚、肯尼亚,澳大利亚、印度、印度尼西亚、巴勒斯坦、日本和我国多个省份多次发生。该病的临床症状包括发热、食欲减退、流眼泪和鼻涕、肌肉收缩僵硬、暂时性的跛足、唾液分泌物增多、抑郁、关节肿胀等症状,严重时则会发生黏膜化脓、颤抖、瘫痪及死亡。BEFV为弹状病毒科、暂时热病毒属成员,只有一个血清型,但根据毒株的差异而将其分为4个不同基因型。其中I型包括日本1988年和1989年的分离株以及我国大陆和台湾1984年分离株,II型主要包括日本2001-2004年的分离株以及我国台湾1996-2004年的分离株,III型为日本1996年的分离株,IV型由澳大利亚分离株组成。BEFV可随动物移动和媒介迁飞呈跳跃式蔓延传播,对养牛业造成重大经济损失,因此建立快速、灵敏、准确、简便的病毒诊断方法,用于疑似感染动物的确诊以及易感媒介的带毒状况监控尤为重要。目前,牛流行热病的实验室诊断主要有(1)病毒分离,如乳鼠脑内接种、Vero、BHK-21等敏感细胞传代,进而与标准免疫血清进行中和试验鉴定;(2)血清学检测,如补体结合试验、免疫荧光试验、G1-EL1SA、阻断ELISA方法和中和试验;(3)分子检测技术,如常规RT-PCR检测技术和LAMP方法等。病毒分离是确诊BEFV感染的可靠方法,但该方法依赖于细胞培养,耗时较长;血清学检测方法适用于通过检测病毒抗体进行流行病学调查或疫苗免疫效果的评价。分子检测技术由于快速简便、灵敏性较高,在BEFV检测中发挥着重要的作用。目前,分子生物学方法已经用于BEFV的检测和基因序列分析(Katoetal.,2009;Zhengetal.,2012),尤其荧光定量RT-PCR更具敏感、特异的优点,避免了电泳等繁琐的步骤,更适合BEFV的快速诊断。2005年,以色列研究人员Stram等建立了针对BEFV抗原基因G的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR用于检测BEFV检测,对当地分离株Yaqum-00和澳大利亚参考毒株BB7721可有效检出,但是由于不同毒株的G基因存在较大的变异,难以保证探针与中国BEFV毒株的绝对匹配性,中国专利技术专利申请201210219927.5公开了用于我国BEFV毒株的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法,为解决匹配性在探针中引入了两个简并碱基,该专利申请在普通探针基础上MGB修饰的探针,它的杂交能力更强,更稳定,但需要专业的公司来制备,增加了检测的成本。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足,可以与已经报道的牛流行热病毒G基因有更好的匹配的用于检测牛流行热病毒引物,以及由这些引物构成的检测试剂盒。本专利技术的一种检测牛流行热病毒引物为:SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。本专利技术的一种检测牛流行热病毒的试剂盒内包括SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。为方便使用,本专利技术的可用于检测牛流性热病毒的试剂盒还包括如下成分:BEFVRNA标准品、阴性质控标准品,荧光定量RT-PCR反应液和荧光定量校正液ROXReferenceDyeII。本专利技术的引物可以与已经报道的牛流行热病毒G基因有较好的匹配,本专利技术的检测试剂盒可更有利于用于检测牛流行热病毒。本专利技术实际上是一种利用牛流行热G基因进行病毒检测同时以牛GAPDH基因为内参的实时荧光相对定量RT-PCR方法。实时荧光定量PCR技术由美国AppliedBiosystems公司于1996年推出,该技术不仅实现了从定性到定量的飞跃,且与常规PCR相比具有特异性强、敏感性高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭等优点,因而在基因表达研究、转基因研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域受到广泛应用。本专利技术在深入分析国内外牛流行热病毒序列的基础上,选择基因信息最为丰富的G基因为检测靶标,设计了特异性的保守引物,同时以表达稳定的GAPDH基因为内参对样品RNA含量进行校正,制备了牛流行热病毒实时荧光相对定量RT-PCR试剂盒。本专利技术中,通过反应条件的优化,使实时定量RT-PCR试剂盒具有良好的敏感性、特异性、重复性,其敏感性比常规RT-PCR高100倍,可以用于牛流行热病毒的相对定量检测,而且该试剂盒通过增加简并碱基,所用引物与4个基因型牛流行热病毒的G基因能较好匹配,减少了漏检的可能。附图说明图1牛流行热病毒检测引物的匹配性。图2实时荧光定量RT-PCR动力学曲线。图3实时荧光定量RT-PCR标准曲线。图4实时荧光定量RT-PCR灵敏度实验。图5普通RT-PCR检测方法电泳图。其中M为DNA分子量标准DL2000;1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别为1011-102拷贝/μLRNA标准品;10为空白对照。图6实时荧光定量RT-PCR特异性试验曲线。图7实时荧光定量RT-PCR广谱性试验曲线。图8实时荧光定量RT-PCR批内重复性试验曲线。图9实时荧光定量RT-PCR批间重复性试验曲线。图10人工感染牛第3天至第7天血液中BEFV核酸的相对水平。具体实施方式本专利技术的检测牛流行热病毒的引物为SEQIDNo.15’-TAGTCACMACVTATGCDATYTAC-3’(正向引物)、SEQIDNo.25’-GTTTACTYCCACYYTTGATGCT-3’(反向引物),目的片段大小为201bp;SEQIDNo.3:5’-GCTCTCTGCTCCTGCCCG-3’(牛GAPDH正向引物)、SEQIDNo.45’-CGACGATGTCCACTTTGCCA-3’(牛GAPDH反向引物),目的片段大小为159bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。在具体应用时还需有:荧光定量PCR反应液、标准阳性RNA、阴性质控标准品。在本实施例中荧光定量PCR反应液由PremixExTaqTM(2×)12.5μL,10μM的正向引物SEQNo.1和10μM的反向引物SEQNo.2各0.5μL,荧光校正液ROXReferenceDyeII(50×)0.5μL,DEPC水10μL。本专利技术试剂盒应用实例标准阳性RNA制备:根据牛流行热病毒G基因序列,设计引物GF1(正向引物):5’-TGTGGAGAACTTCATCCTGTA-3’SEQNo.5,GR1(反向引物):5’-AGAATCTATCATCACCGATTGG-3’SEQNo.6,进行RT-PCR扩增获得牛流行热病毒JT02株G基因片段,长度为1786bp,回收目的片段,与pGEM-Teasy(Promega公司)进行连接,转化JM109感受态细胞,以载体负向引物M13R5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’SEQNo.7和G本文档来自技高网
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一种检测牛流行热病毒的引物及检测试剂盒

【技术保护点】
一种检测牛流行热病毒的引物,其特征在于所述的引物为:SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。

【技术特征摘要】
1.一种检测牛流行热病毒的引物,其特征在于所述的引物为:SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。2.一种检测牛流行热病毒的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒内包括SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、...

【专利技术属性】
技术研发人员:殷宏高闪电独军政田占成郑福英刘志杰杨吉飞
申请(专利权)人:中国农业科学院兰州兽医研究所
类型:发明
国别省市:甘肃,62

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