肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类肿瘤治疗心脏毒性相关38个基因上总共56种遗传性变异位点。本发明专利技术的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要45分钟即可，可以十分有效的解决目前对于临床上患者接受肿瘤药物治疗前预测是否会发生较大心脏毒性，而需要对体细胞多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。

Construction method of gene mutation detection library for tumor treatment cardiac toxicity prediction

The invention discloses a tumor treating heart toxicity prediction gene mutation library construction method, which is characterized in that: a total of 56 kinds of genetic mutation sites covering human tumor therapy related cardiac toxicity of 38 genes. The construction method of the invention for multiple target sequences were single, rapid completion of library construction, the library construction requires only 2 to 3 hours of manual time only need 45 minutes, can be a very effective solution to the current for patients receiving cancer treatment prior to predict whether there will be great cardiac toxicity, and need the somatic cells of multiple genes and target detection of this difficulty, and low cost.

【技术实现步骤摘要】
肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法
本专利技术涉及一种用于高通量测序检测的肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变文库的构建方法。
技术介绍
随着多学科综合治疗的发展及早期筛查的推广，近30年来癌症死亡率呈现持续下降，然而，系统治疗相关的脏器损伤发生率持续升高。随着肿瘤患者生存期延长，心血管疾病俨然已成为第二大致死病因。心血管事件可能对肿瘤患者生存及生活质量构成重大风险。早期乳腺癌的5年生存率已经从79％提高到88％。据报道，心血管死亡率可能成为乳腺癌患者10年后的主要死因。许多研究显示，大约75％诊断乳腺癌且存活10年的患者，治疗心脏疾病有利于延长患者的总生存。传统化疗药物以及肿瘤靶向药物，常常可引起包括左室功能减退、心力衰竭、高血压、血管痉挛、血栓相关性心肌缺血、QT间期延长等心血管事件。严重的QT间期延长又可以导致室性心律失常的发生。心脏毒性具有不同的临床表现：接受蒽环类药物所致心脏毒性表现为持续的和不可逆的心肌损伤，接受曲妥珠单抗治疗所致心脏毒性表现为可逆性心脏功能受损。因此，肿瘤系统治疗面临的挑战不仅仅是选择最优的方案，同时还需兼顾降低治疗过程中对重要靶器官(譬如心脏)的损伤。蒽环类相关心脏毒性呈剂量依赖性，通过诱发活性氧介导的铁依赖性化学反应即心肌氧化应激，导致心肌细胞损伤和进行性肌细胞丢失，导致左心室壁变薄，增加后负荷，减少收缩。心肌抑制作用还可能与拓扑异构酶有关，特别是拓扑异构酶IIβ(TOP2β)，TOP2β在心肌细胞中表达，介导蒽环类药物诱导的心肌病，通过各种途径引发细胞死亡。急性心脏毒性为心电图变化和/或心律失常。慢性心脏毒性主要表现为左心室射血分数降低，蒽环类药物所致心力衰竭发生率为3-30％，死亡率高达72％。这类药物仍然是癌症治疗后心血管发病率和死亡率的主要原因。乳腺癌治疗的众多靶向药物中，目前曲妥珠单抗对心脏功能的影响研究较为明确，25％乳腺癌患者过表达HER-2基因，曲妥珠单抗治疗使乳腺癌复发率降低50％、死亡率降低30％，但同时也提高了3.9％的心衰事件发生率。心脏收缩功能下降是主要心脏毒性，心力衰竭和心血管死亡事件发生率<1％和<0.5％。其影响心脏功能的作用机制可能与直接抑制心肌细胞表面的ErbB2相关。不同于蒽环类药物，曲妥珠单抗引起的心脏功能障碍多数是可逆的。临床中观察到有些患者可耐受较高剂量的蒽环类药物而未表现出心脏毒性，而有些患者耐受剂量不足阈值的一半即表现严重心脏毒副反应，为什么一些个体对蒽环类药物的心脏毒性特别敏感，以及如何识别哪些患者更容易受到药物诱导的氧化损伤和细胞凋亡尚不清楚。超声心动图用于监测左心射血分数及心肌应变率，左室射血分数<50％或者比基础值低10％以上，可能提示患者发生心脏毒性的风险明显增高。心脏相关标记物尤其是肌钙蛋白用于监测、评估肿瘤治疗过程中心肌损伤的情况。但在临床实践当中，尚缺乏有效的预测因子判断患者对蒽环类药物的耐受性和药物反应性。如何筛选更敏感且能够耐受其毒性的患者接受治疗，是目前临床实践的一大挑战。药物不良效应的出现也是癌症治疗失败的主要原因。表观遗传和基因组的多态性与肿瘤治疗疗效相关联，单核苷酸多态性(SNP)是最常见的引起肿瘤特异性的表现形式，大多数患者疗效间的差异和毒性差异产生于SNP的遗传变异，其影响抗癌药物代谢通路和化疗药物代谢酶的靶基因。随着全基因组的研究进展，越来越多与药物代谢酶活性相关的基因位点多态性在不同的人群中得以证实。因此，研究药物代谢酶基因的多态性，探讨其在疗效预测及毒性反应的价值，也是个体化治疗的重要探索方向。基因库的建立有助于更密切的监测，帮助建立基因组评分改善药物有效性预测系统，鉴定高风险患者从而提供更安全的治疗方案。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述不足，本专利技术提供了一种用于高通量测序检测的肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下技术方案：肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法，覆盖人类基因UGT1A6、FANCD2、ABCC5、PIK3R1、SLC22A7、VEGF、GSTA1、SLC22A16、ABCB1、CYP3A5、CYP3A4、SLC28A3、ESR2、AKR1C3、CYP2C8、ABCC2、CAT、GSTP1、SLCO1B3、RARG、SLC22A17、TCL1A、MRP1、ABCC1、NQO1、CYBA、HER2、RAPTOR、CYP2B6、CBR1、NCF4、RAC2、CYP2D6、CBR3、NOS3、ESR1、CELF4和DPD上的总共56种遗传性变异位点，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因UGT1A6、FANCD2、ABCC5、PIK3R1、SLC22A7、VEGF、GSTA1、SLC22A16、ABCB1、CYP3A5、CYP3A4、SLC28A3、ESR2、AKR1C3、CYP2C8、ABCC2、CAT、GSTP1、SLCO1B3、RARG、SLC22A17、TCL1A、MRP1、ABCC1、NQO1、CYBA、HER2、RAPTOR、CYP2B6、CBR1、NCF4、RAC2、CYP2D6、CBR3、NOS3、ESR1、CELF4和DPD设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得文库产物；(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤基因变异文库；上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。作为本专利技术的一种优选方案，所述基本扩增引物组包括ZQ-XZ-UGT1A6-1-F、ZQ-XZ-UGT1A6-1-R、ZQ-XZ-FANCD2-2-F、ZQ-XZ-FANCD2-2-R、ZQ-XZ-FANCD2-1-F、ZQ-XZ-FANCD2-1-R、ZQ-XZ-ABCC5-1-F、ZQ-XZ-ABCC5-1-R、ZQ-XZ-ABCC5-2-F、ZQ-XZ-ABCC5-2-R、ZQ-XZ-PIK3R1-1-F、ZQ-XZ-PIK3R1-1-R、ZQ-XZ-SLC22A7-1-F、ZQ-XZ-SLC22A7-1-R、ZQ-XZ-VEGF-1-F、ZQ-XZ-VEGF-1-R、ZQ-XZ-GSTA1-1-F、ZQ-XZ-GSTA1-1-R、ZQ-XZ-SLC22A16-1-F、ZQ-XZ-SLC22A16-1-R、ZQ-XZ-ABCB1-2-F、ZQ-XZ-ABCB1-2-R、ZQ-XZ-ABCB1-3-F、ZQ-XZ-ABCB1-3-R、ZQ-XZ-ABCB1-4-F、ZQ-XZ-ABCB1-4-R、ZQ-XZ-ABCB1-1-F、ZQ-XZ-ABCB1-1-R、ZQ-XZ-CYP3A5-1-F、ZQ-XZ-CYP3A5-1-R、ZQ-XZ-CYP3A5-2-F、ZQ-XZ-CYP3A5-2-R、ZQ-XZ-CYP3A4本文档来自技高网...

【技术保护点】
肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法，其特征在于，覆盖人类基因UGT1A6、FANCD2、ABCC5、PIK3R1、SLC22A7、VEGF、GSTA1、SLC22A16、ABCB1、CYP3A5、CYP3A4、SLC28A3、ESR2、AKR1C3、CYP2C8、ABCC2、CAT、GSTP1、SLCO1B3、RARG、SLC22A17、TCL1A、MRP1、ABCC1、NQO1、CYBA、HER2、RAPTOR、CYP2B6、CBR1、NCF4、RAC2、CYP2D6、CBR3、NOS3、ESR1、CELF4和DPD上的总共56种遗传性变异位点，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因UGT1A6、FANCD2、ABCC5、PIK3R1、SLC22A7、VEGF、GSTA1、SLC22A16、ABCB1、CYP3A5、CYP3A4、SLC28A3、ESR2、AKR1C3、CYP2C8、ABCC2、CAT、GSTP1、SLCO1B3、RARG、SLC22A17、TCL1A、MRP1、ABCC1、NQO1、CYBA、HER2、RAPTOR、CYP2B6、CBR1、NCF4、RAC2、CYP2D6、CBR3、NOS3、ESR1、CELF4和DPD设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap‑Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap‑Taq酶混合进行PCR，纯化后获得文库产物；(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤基因变异文库；上述RingCap‑Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。...

【技术特征摘要】
1.肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法，其特征在于，覆盖人类基因UGT1A6、FANCD2、ABCC5、PIK3R1、SLC22A7、VEGF、GSTA1、SLC22A16、ABCB1、CYP3A5、CYP3A4、SLC28A3、ESR2、AKR1C3、CYP2C8、ABCC2、CAT、GSTP1、SLCO1B3、RARG、SLC22A17、TCL1A、MRP1、ABCC1、NQO1、CYBA、HER2、RAPTOR、CYP2B6、CBR1、NCF4、RAC2、CYP2D6、CBR3、NOS3、ESR1、CELF4和DPD上的总共56种遗传性变异位点，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因UGT1A6、FANCD2、ABCC5、PIK3R1、SLC22A7、VEGF、GSTA1、SLC22A16、ABCB1、CYP3A5、CYP3A4、SLC28A3、ESR2、AKR1C3、CYP2C8、ABCC2、CAT、GSTP1、SLCO1B3、RARG、SLC22A17、TCL1A、MRP1、ABCC1、NQO1、CYBA、HER2、RAPTOR、CYP2B6、CBR1、NCF4、RAC2、CYP2D6、CBR3、NOS3、ESR1、CELF4和DPD设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；(2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得文库产物；(3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤基因变异文库；上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。2.根据权利要求1所述的肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法，其特征在于：所述基本扩增引物组包括ZQ-XZ-UGT1A6-1-F、ZQ-XZ-UGT1A6-1-R、ZQ-XZ-FANCD2-2-F、ZQ-XZ-FANCD2-2-R、ZQ-XZ-FANCD2-1-F、ZQ-XZ-FANCD2-1-R、ZQ-XZ-ABCC5-1-F、ZQ-XZ-ABCC5-1-R、ZQ-XZ-ABCC5-2-F、ZQ-XZ-ABCC5-2-R、ZQ-XZ-PIK3R1-1-F、ZQ-XZ-PIK3R1-1-R、ZQ-XZ-SLC22A7-1-F、ZQ-XZ-SLC22A7-1-R、ZQ-XZ-VEGF-1-F、ZQ-XZ-VEGF-1-R、ZQ-XZ-GSTA1-1-F、ZQ-XZ-GSTA1-1-R、ZQ-XZ-SLC22A16-1-F、ZQ-XZ-SLC22A16-1-R、ZQ-XZ-ABCB1-2-F、ZQ-XZ-ABCB1-2-R、ZQ-XZ-ABCB1-3-F、ZQ-XZ-ABCB1-3-R、ZQ-XZ-ABCB1-4-F、ZQ-XZ-ABCB1-4-R、ZQ-XZ-ABCB1-1-F、ZQ-XZ-ABCB1-1-R、ZQ-XZ-CYP3A5-1-F、ZQ-XZ-CYP3A5-1-R、ZQ-XZ-CYP3A5-2-F、ZQ-XZ-CYP3A5-2-R、ZQ-XZ-CYP3A4-1-F、ZQ-XZ-CYP3A4-1-R、ZQ-XZ-CYP3A4-2-F、ZQ-XZ-CYP3A4-2-R、ZQ-XZ-SLC28A3-1-F、ZQ-XZ-SLC28A3-1-R、ZQ-XZ-ESR2-1-F、ZQ-XZ-ESR2-1-R、ZQ-XZ-AKR1C3-1-F、ZQ-XZ-AKR1C3-1-R、ZQ-XZ-CYP2C8-2-F、ZQ-XZ-CYP2C8-2-R、ZQ-XZ-CYP2C8-1-F、ZQ-XZ-CYP2C8-1-R、ZQ-XZ-ABCC2-1-F、ZQ-XZ-ABCC2-1-R、ZQ-XZ-ABCC2-2-F、ZQ-XZ-ABCC2-2-R、ZQ-XZ-CAT-1-F、ZQ-XZ-CAT-1-R、ZQ-XZ-GSTP1-1-F、ZQ-XZ-GSTP1-1-R、ZQ-XZ-SLCO1B3-1-F、ZQ-XZ-SLCO1B3-1-R、ZQ-XZ-RARG-1-F、ZQ-XZ-RARG-1-R、ZQ-XZ-SLC22A17-1-F、ZQ-XZ-SLC22A17-1-R、ZQ-XZ-TCL1A-3-F、ZQ-XZ-TCL1A-3-R、ZQ-XZ-TCL1A-4-F、ZQ-XZ-TCL1A-4-R、ZQ-XZ-TCL1A-1-F、ZQ-XZ-TCL1A-1-R、ZQ-XZ-TCL1A-2-F、ZQ-XZ-TCL1A-2-R、ZQ-XZ-MRP1-1-F、ZQ-XZ-MRP1-1-R、ZQ-XZ-MRP1-2-F、ZQ-XZ-MRP1-2-R、ZQ-XZ-ABCC1-3-F、ZQ-XZ-ABCC1-3-R、ZQ-XZ-ABCC1-1-F、ZQ-XZ-ABCC1-1-R、ZQ-XZ-ABCC1-2-F、ZQ-XZ-ABCC1-2-R、ZQ-XZ-NQO1-1-F、ZQ-XZ-NQO1-1-R、ZQ-XZ-CYBA-1-F、ZQ-XZ-CYBA-1-R、ZQ-XZ-HER2-2-F、ZQ-XZ-HER2-2-R、ZQ-XZ-HER2-1-F、ZQ-XZ-HER2-1-R、ZQ-XZ-RAPTOR-1-F、ZQ-XZ-RAPTOR-1-R、ZQ-XZ-CYP2B6-1-F、ZQ-XZ-CYP2B6-1-R、ZQ-XZ-CBR1-1-F、ZQ-XZ-CBR1-1-R、ZQ-XZ-NCF4-1-F、ZQ-XZ-NCF4-1-R、ZQ-XZ-RAC2-1-F、ZQ-XZ-RAC2-1-R、ZQ-XZ-CYP2D6-1-F、ZQ-XZ-CYP2D6-1-R、ZQ-XZ-CBR3-1-F、ZQ-XZ-CBR3-1-R、ZQ-XZ-NOS3-1-F、ZQ-XZ-NOS3-1-R、ZQ-XZ-ESR1-1-F、ZQ-XZ-ESR1-1-R、ZQ-XZ-CELF4-1-F、ZQ-XZ-CELF4-1-R、ZQ-XZ-DPD-1-F、ZQ-XZ-DPD-1-R、ZQ-XZ-DPD-2-F、ZQ-XZ-DPD-2-R、ZQ-XZ-DPD-3-F和ZQ-XZ-DPD-3-R。3.根据权利要求2所述的肿瘤治疗心脏毒性预测基因突变检测文库的构建方法，其特征在于：JER-2基因引物名称：ZQ-XZ-HER2-1-F，序列信息TTTTGGGTCACCTTCTCTTGACCTTT；ZQ-XZ-HER2-1-R，序列信息TTTTAAAGGCAAAAACGTCTTTGACGA；ZQ-XZ-HER2-2-F，序列信息TTTTTCCGAATGCCAAACACCTTCA；ZQ-XZ-HER2-2-R，序列信息TTTTGATGAGGATCCCAAA；CYP3A5基因引物名称：ZQ-XZ-CYP3A5-1-F，序列信息TTTTATGTCAAGAAAGCAGTTATTTTTAA；ZQ-XZ-CYP3A5-1-R，序列信息TTTTTTACTGGCACATCA；ABCB1基因引物名称：ZQ-XZ-ABCB1-1-F，序列信息TTTTTCTGCATCAGCTGGACTGTTG；ZQ-XZ-ABCB1-1-R，序列信息TTTTACCTAGTGAACAGTCAG；CYP2C8基因引物名称：ZQ-XZ-CYP2C8-1-F，序列信息TTTTGGTCAATGACGCAGAGTAGAGTC；ZQ-XZ-CYP2C8-1-R，序列信息TTTTATTTCCAGCAATGGAAAGAGATG；CYBA基因引物名称：ZQ-XZ-CYBA-1-F，序列信息TTTTGCCCGAACATAGTAATTCCTGGT；ZQ-XZ-CYBA-1-R，序列信息TTTTGTGGTCAGCAG；VEGF基因引物名称：ZQ-XZ-VEGF-1-F，序列信息TTTTCCCAAATCACTGTGGATTTTGGA；ZQ-XZ-VEGF-1-R，序列信息TTTTCCAAAAGCAGGTCACTCACTT；RAC2基因引物名称：ZQ-XZ-RAC2-1-F，序列信息TTTTGACCATGTTTTCATCTAGTGCCT；ZQ-XZ-RAC2-1-R，序列信息TTTTTGGTCTCTGGGTTCCTTGAATG；NQO1基因引物名称：ZQ-XZ-NQO1-1-F，序列信息TTTTGGCTGCTTGGAGCAAAATACAG；ZQ-XZ-NQO1-1-R，序列信息TTTTTGTATCCTCAGAGTGGCATTCTG；GSTP1基因引物名称：ZQ-XZ-GSTP1-1-F，序列信息TTTTAGTGACTGTGTGTTGATCAGGC；ZQ-XZ-GSTP1-1-R，序列信息TTTTAGATGCTCACATAGTTGGTGTAGATG；CYP2D6基因引物名称：ZQ-XZ-CYP2D6-1-F，序列信息TTTTCTCACGGCTTTGTCCAAGAGA；ZQ-XZ-CYP2D6-1-R，序列信息TTTTGTGATGGGCAGAAGGGCACAAAG；CYP3A5基因引物名称：ZQ-XZ-CYP3A5-2-F，序列信息TTTTCACAGCAACCTTAGGTTCTAGTTCA；ZQ-XZ-CYP3A5-2-R，序列信息TTTTGAATGCTCTACTGTCATTTCTAACCAT；CYP3A4基因引物名称：ZQ-XZ-CYP3A4-1-F，序列信息TTTTTATGCATGCAACAGGAAACCCACA；ZQ-XZ-CYP3A4-1-R，序列信息TTTTAGGTAGGTCTAATTCAGTTCAGTGTCT；CYP2C8基因引物名称：ZQ-XZ-CYP2C8-2-F，序列信息TTTTAAATGGAAACGAGTTTCTATTACCTGC；ZQ-XZ-CYP2C8-2-R，序列信息TTTTTACTTCCAGGGCACAACCATAATG；CYP3A4基因引物名称：ZQ-XZ-CYP3A4-2-F，序列信息TTTTGGAGCCATTGGCATAAAATCTATTAAAT；ZQ-XZ-CYP3A4-2-R，序列信息TTTTGTTTGGAAGGATGTGTAGGAGTCTT；MRP1基因引物名称：ZQ-XZ-MRP1-1-F，序列信息TTTTCCTTCCCTGAAGGGTGACATTC；ZQ-XZ-MRP1-1-R，序列信息TTTTGCATCCACCTTGGAACTCTCTTTC；CBR1基因引物名称：ZQ-XZ-CBR1-1-F，序列信息TTTTCAGCTGGACATCGACGATCT；ZQ-XZ-CBR1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：辇伟奇，张娜，李丽仙，刘海霞，葛闯，曹勇，唐万燕，何永鹏，
申请(专利权)人：重庆市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：重庆,50