一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒，该方法包括：在DNA片段化及末端修复反应体系中，在打断酶、末端修复酶的作用下，将均一化的DNA样本片段化并末端修复；在DNA连接酶的作用下，将上一步所得的产物与接头序列连接；以上一步所得的接头连接产物为模板，在DNA聚合酶的作用下，使用接头序列的引物进行PCR扩增；使用包含BRCA1/2基因的探针序列与上一步的产物进行杂交以捕获含有BRCA1/2基因的DNA片段，并洗脱以获取杂交捕获产物；在连接酶的作用下，使杂交捕获产物的单链实现环化，得到BRCA1/2基因检测文库。本发明专利技术的建库步骤简便快速，有效降低成本，减少工作量，变异类型全面、准确、通量高。

Construction method and kit for BRCA1/2 gene detection Library

The invention discloses a construction of a BRCA1/2 Library of gene detection method and kit, the method comprises the following steps: in the repair of the reaction system and terminal fragment of DNA, in the end, repair interrupted enzyme enzyme, DNA fragment and end repair sample homogenization; in the DNA connection under the action of the enzyme, the a step of the product is connected with the joint sequence; one step above the joint connection products as template, in under the action of DNA polymerase, PCR primer using joint sequence; using the probe sequence containing BRCA1/2 gene and a step of the product was hybridized to capture BRCA1/2 gene containing DNA fragment, and elution to obtain hybrid capture products; in ligase, the single hybrid capture product realization, by detection of BRCA1/2 gene library. The method of the database construction of the invention is simple and fast, effectively reduces the cost and reduces the workload, and the variation type is comprehensive, accurate and high in flux.

【技术实现步骤摘要】
一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒。
技术介绍
根据国家癌症中心在《临床医师癌症杂志》上公布的2015年癌症统计数据，中国妇女卵巢癌年发病5.21万例，年死亡2.25万例，死亡率约为43％，为妇科三大肿瘤之首。乳腺癌年发病27.2万例，年死亡7.07万例，死亡率约为26％。另外，美国癌症学会研究显示，I型乳腺癌的患者5年生存率达到88％，IV型乳腺癌的5年生存率只有15％，这说明级别越高，生存率越低；发现越早，生存率越高。因此，采用合理的预防措施对于乳腺癌及卵巢癌的“早发现，早诊断，早治疗”具有重要意义。随着人类基因密码的解开，愈来愈多的疾病被发现与遗传因子有关，尤其对于癌症而言，遗传物质的差异对疾病的发生率、疾病的临床过程、以及对不同治疗的反应程度都将有一定程度的影响。基因作为遗传信息的记录体和传递者可以反映出个体肿瘤的遗传携带情况并用于评估个体易感风险。BRCA1/2是两种具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。目前在ESMO及NCCN指南中对于乳腺癌和卵巢癌高危人群进行BRCA1/2基因检测均有推荐。据文献报道，约有5％～10％的乳腺癌和10～18％的卵巢癌是由生殖系BRCA1/2突变引起的。据统计，约有50％的遗传性乳腺癌和90％的遗传性卵巢癌有生殖细胞上的BRCA1突变；约有40％的遗传性乳腺癌和5％～10％的遗传性卵巢癌伴有BRCA2的突变。在家族遗传性乳腺癌和/或卵巢癌患者亲属中，BRCA1携带者、BRCA2携带者和非BRCA1/BRCA2携带者的比例分别约为65％、75％、43.5％。此外，一项综合研究调查结果表明：在BRCA1突变携带者中，70岁时发生乳腺癌的机率为65％，发生卵巢癌的机率为39％；在BRCA2突变携带者中，70岁时发生乳腺癌的和卵巢癌的机率分别为45％和11％。因此，BRCA1/2基因突变检测对于高危人群乳腺癌和卵巢癌风险评估具有积极的作用。此外，研究发现多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂可以通过抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡，从而增强放疗以及烷化剂和铂类药物化疗的疗效。不仅如此，PARP抑制剂作为单药对BRCA突变的患者也有显著疗效。由于BRCA有害突变的癌症患者体内基因重组功能已经缺失，再通过PARP抑制剂抑制DNA的修复，就可以通过协同致死作用杀死肿瘤细胞。2014年12月，FDA已经批准PARP抑制剂奥拉帕尼(Olaparib)单药治疗BRCA1/2有害胚系突变的晚期卵巢癌患者。另外还有其他多种PARP抑制剂在临床第一、二、三期科研阶段。检测BRCA基因的突变可以指导未来PARP抑制剂的合理用药。因此，进行BRCA1/2的基因突变检测尤其对于卵巢癌的“早发现，早诊断，早治疗”具有重要的临床意义。BRCA1/2基因大、序列长。根据BIC数据库(BreastCancerInformationCore,http://research.nhgri.nih.gov/bic/)，BRCA1/2基因目前已报道的变异类型包括无义突变、移码突变、非移码插入、非移码缺失、错义突变、同义突变、剪接位点突变，以及发生在非翻译区和内含子区域的突变，涉及到近4000个变异位点，而这些突变多数基本上散布于各个外显子，没有证据表明存在突变热点区域，只存在少数几个相对高频的变异位点。如果采用传统的sanger测序或qPCR检测的方法来对BRCA1/2整个基因进行检测，则需要耗费大量的时间且价格不菲。相比之下，二代测序技术可则更为高效快速且价格低廉的，可以一次性对BRCA1/2基因整个外显子及邻近内含子进行变异检测，变异类型可包括点突变(SNP)、插入缺失(Indel)、基因融合及拷贝数变化(CNV)，检测十分全面。聚合酶链式反应结合sanger测序检测BRCA1/2突变，以MyriadGenetics公司的BRACAnalysisCDx试剂盒为例，根据检测目标设计大量引物对对血液来源gDNA进行PCR扩增，从而对BRCA1/2基因进行富集，随后采用一代测序法进行检测，再根据已知的原始序列找出对应的突变。针对不同的变异类型如单核苷酸变异、短片段插入缺失与大片段缺失或重复，需要设计不同的引物。聚合酶链式反应结合sanger测序检测BRCA1/2突变存在很大局限性，表现在：该方法更适合于候选致病位点明确的疾病，而对于候选基因或位点数目较多的大样本病例筛查是难以完成的，该方法本身是高成本、高人工投入的。另外，Sanger测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型；对于连续多个碱基的小片段插入、缺失检出准确度下降或者不能检出；检测过程复杂，同一次检测中单核苷酸变异、短片段插入缺失与大片段缺失与重复需要两次PCR反应单独检测。二代测序技术检测BRCA1/2突变，需要制备二代测序文库。制备文库中的基因组DNA片段化方法主要是通过物理打断或化学打断来实现的。物理打断需要借助打断仪，基于超声剪切原理可将DNA打断成100-1500bp片段；化学打断法主要依赖于酶打断法，经酶打断后能产生100-800bp的片段。DNA双链片段化利用的是一种时间依赖型酶，根据不同的反应时间，将双链DNA切割成100-800片段。文库构建一般需要分步骤进行，物理打断法及常规的酶打断法进行片段化后需要进一步通过凝胶电泳或磁珠选择合适大小的片段筛选，随后进行末端修复、加A、加接头等步骤，步骤多且繁琐，操作时间长，容易造成污染。通过物理打断法对DNA进行打断需要投入打断仪，增加建库成本、仪器维护成本以及人工操作成本，而且打断需求的原始进样体积较大。因此必须要经过磁珠纯化富集DNA片段，才能进行后续的建库步骤，进一步增加了人工操作及片段损失。
技术实现思路
本专利技术提供一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒，建库步骤简便快速，有效降低成本，减少工作量，变异类型全面、准确、通量高。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法，包括：(1)在DNA片段化及末端修复反应体系中，在打断酶、末端修复酶的作用下，将均一化的DNA样本片段化并末端修复；(2)在接头连接体系中，在DNA连接酶的作用下，将步骤(1)所得的产物与接头序列连接；(3)以步骤(2)所得的接头连接产物为模板，在DNA聚合酶的作用下，使用接头序列的引物进行PCR扩增；(4)使用包含BRCA1/2基因的探针序列与步骤(3)的产物进行杂交以捕获含有上述BRCA1/2基因的DNA片段，并洗脱以获取杂交捕获产物；(5)在单链环化体系中，在连接酶的作用下，使上述杂交捕获产物的单链实现环化，得到上述BRCA1/2基因检测文库。进一步地，上述接头序列带有用于区分不同DNA样本的条形码序列，每一上述条形码序列对应一种DNA样本；相应地，在步骤(3)之后，将来源于多个DNA样本的上述步骤(3)的PCR扩增产物混合在一起并纯化，以用于步骤(4)中的杂交捕获。进一步地，在步骤(4)和步骤(5)之间，还包括：(4’)以步骤(4)所得的杂交捕获产物为模板，在DNA聚合酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括：(1)在DNA片段化及末端修复反应体系中，在打断酶、末端修复酶的作用下，将均一化的DNA样本片段化并末端修复；(2)在接头连接体系中，在DNA连接酶的作用下，将步骤(1)所得的产物与接头序列连接；(3)以步骤(2)所得的接头连接产物为模板，在DNA聚合酶的作用下，使用接头序列的引物进行PCR扩增；(4)使用包含BRCA1/2基因的探针序列与步骤(3)的产物进行杂交以捕获含有所述BRCA1/2基因的DNA片段，并洗脱以获取杂交捕获产物；(5)在单链环化体系中，在连接酶的作用下，使所述杂交捕获产物的单链实现环化，得到所述BRCA1/2基因检测文库。

【技术特征摘要】
1.一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括：(1)在DNA片段化及末端修复反应体系中，在打断酶、末端修复酶的作用下，将均一化的DNA样本片段化并末端修复；(2)在接头连接体系中，在DNA连接酶的作用下，将步骤(1)所得的产物与接头序列连接；(3)以步骤(2)所得的接头连接产物为模板，在DNA聚合酶的作用下，使用接头序列的引物进行PCR扩增；(4)使用包含BRCA1/2基因的探针序列与步骤(3)的产物进行杂交以捕获含有所述BRCA1/2基因的DNA片段，并洗脱以获取杂交捕获产物；(5)在单链环化体系中，在连接酶的作用下，使所述杂交捕获产物的单链实现环化，得到所述BRCA1/2基因检测文库。2.根据权利要求1所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述接头序列带有用于区分不同DNA样本的条形码序列，每一所述条形码序列对应一种DNA样本；相应地，在步骤(3)之后，将来源于多个DNA样本的所述步骤(3)的PCR扩增产物混合在一起并纯化，以用于步骤(4)中的杂交捕获。3.根据权利要求1所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法，其特征在于，在步骤(4)和步骤(5)之间，还包括：(4’)以步骤(4)所得的杂交捕获产物为模板，在DNA聚合酶的作用下，使用接头序列的引物进行PCR扩增，以增加所述杂交捕获产物的量。4.根据权利要求1-3任一项所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述末端修复酶包括：Klenow片段、Taq酶和T4多聚核苷酸激酶；任选地，所述打断酶为DNA片段化酶。5.根据权利要求1-3任一项所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述接头序列按照5’端至3’端的顺序如下所示：长链序列：AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA(SEQIDNO：1)，其中NNNNNNNNNN表示所述条形码序列；短链序列：TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQIDNO：2)；相应地，所述接头序列的引物按照5’端至3’端的顺序如下所示：上游引物：GAACGACATGGCTACGA(SEQIDNO：13)；下游引物：TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQIDNO：14)。6.根据权利要求1-3任一项所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(4)的杂交之前先使用阻断序列对步骤(3)的产物进行处理，以阻断非特异性结合；优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红梅，叶明芝，李世勇，苏孟媛，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，天津华大医学检验所有限公司，广州华大基因医学检验所有限公司，华大生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44