一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法，包括以下步骤：(1)设计特异性引物和探针：以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；(2)合成上述特异性引物和探针；(3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。本发明专利技术操作简便易行，省去了已点样基因芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需2h，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，可用于大规模检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法。
技术介绍
副猪嗜血杆菌(Haemophliusparasuis，HPS)是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellacea)嗜血杆菌属(Haemophilus)，有15种血清型，还有20％的菌株血清型无法确定。该菌能够引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的副猪嗜血杆菌病又称为猪革拉斯氏病(disease)。HPS可以影响2周龄～4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，常见于5～8周龄，发病率可达40％，严重时死亡率可达50％。随着我国规模化养猪场的发展，HPS感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，每年给我国养猪业造成巨大经济损失。因此，建立一种副猪嗜血杆菌的检测技术，对于监控该菌的繁殖、疾病发生和流行以及疾病的及时防治都具有重要的意义。现有的副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)检测方法有病原学检测技术、血清学鉴定及分子生物学检测技术(如：PCR检测)等。微生物学检测方法是根据细菌的形态、培养特性和生化特性等进行鉴定。副猪嗜血杆菌在显微镜下呈长丝状或球杆状，大小为1.5μm×(0.3～0.4)μm，是革兰氏染色阴性小杆菌，且革兰氏染色常常呈现两极着色。该菌无鞭毛，不运动，无芽孢，通常有荚膜。Hps是需氧或兼性厌氧菌，在适宜的培养基上生长的菌落只有针尖大小，呈圆形、湿润、稍隆起的灰白色半透明状且表面光滑，边缘整齐。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血凝试验(IH)、琼脂扩散试验、补体结合试验等。其中ELISA与间接血凝试验的应用最为广泛。PCR检测方法有很强的特异性和高度的敏感性。基因芯片作为检测手段，有高灵敏性、高度精确性、高信息量等优点，被应用于多种微生物的检测中，已建立有针对猪病致病菌的基因芯片的检测方法，但需要对已点样的基因芯片进行水化和预杂交处理，且所需杂交探针的浓度较高，检测成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供提供一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法，可有效解决现有检测设备及方法耗时长，投入大的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：(1)设计特异性引物和探针：以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQIDNO：3所示；(2)对上述特异性引物和探针进行合成，制得合成探针；(3)基因芯片的制备：用TEBuffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。作为本专利技术进一步的方案：步骤(2)中所述的特异性引物浓度为10μM/L。作为本专利技术进一步的方案：步骤(3)中所述的探针浓度为5μM/L-20μM/L。作为本专利技术进一步的方案：步骤(3)中接触式点样的环境参数为相对湿度55％-65％，温度15℃-30℃。作为本专利技术进一步的方案：步骤(3)中，干燥过程是静置于80℃烘箱干燥2小时。一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：(1)提取待测副猪嗜血杆菌细菌的基因组DNA；(2)杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成分，然后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增。所述的反应体系为：5μl5×Buffer，1μl上游引物，2μl下游引物，2.0μldNTP，1.0μl模板DNA，0.3μlPrimeSTAR，13.7μlddH2O，总体积为25μl；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃延伸5min；(3)杂交用PCR产物与用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片杂交：将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取杂交用PCR产物40μl和杂交缓冲液160μl加入离心管中，混匀后取该混合液加到基因芯片的点样区，将基因芯片放入杂交盒内，置于49℃水浴锅中避光杂交2h；(4)杂交后基因芯片的洗涤与干燥：将杂交后基因芯片放置在玻片架上，立即用洗液洗涤三次，每次2min，离心干燥；(5)洗涤后基因芯片的结果分析：将洗涤后基因芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值。作为本专利技术进一步的方案：dNTP的浓度为10mmol/μl。作为本专利技术进一步的方案：基因芯片三次洗涤所用洗液依次分别为1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC。作为本专利技术进一步的方案：基因芯片杂交结果判定的依据如下：(1)模板DNA的PCR扩增效果良好；(2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；(3)检测基因芯片的杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，且SNR≥1.5。本专利技术与现有技术相比有如下有益效果：本专利技术操作简便易行，省去了已点样基因芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需2h，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用5μm/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。附图说明图1为本专利技术的副猪嗜血杆菌基因芯片点样示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例11材料与方法1.1材料1.1.1标准菌株来源副猪嗜血杆菌由河南牧业经济学院惠赠。1.1.2芯片材料基因芯片基片采用醛基化基片，购自博奥经典生物技术有限公司。1.1.3试验仪器基因芯片点样仪美国Bio-Dot公司MILIPORE-21JO纯水机美国MILIPORE公司YEAR2000PCR仪英国WhatmanBiometra公司DBT-07凝胶成像系统英国UVITEC公司MLTRAPR080型超高速冷冻离心机德国HermLer公司TGL-16C台式高速低温离心机德国Eppendorf公司基因芯片扫描仪法国Innopsys公司-80℃超低温冰柜Thermo公司Tanon2500全自动数码凝胶成像分析系统上海天能科技有限公司YJ-875净化工作台苏州净化设备公司SHA-C水浴恒温振荡器江苏恒丰仪器厂DYY-31A型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂DBT-07凝胶成像系统英国UVITEC公司PCR扩增仪Biometra公司1.1.4主要试剂和溶液TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0大连宝生物工程有限公司ExTaqTM酶、DNAMarkerDL500大连宝生物工程有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)北京索莱宝科技有限公司ProteinaseK,Tritirachiumalb本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计特异性引物和探针：以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；(2)对上述特异性引物和探针进行合成，制得合成探针；(3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计特异性引物和探针：以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQIDNO：3所示；(2)对上述特异性引物和探针进行合成，制得合成探针；(3)基因芯片的制备：用TEBuffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。2.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的特异性引物浓度为10μM/L。3.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的探针浓度为5μM/L-20μM/L。4.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中接触式点样的环境参数为相对湿度55％-65％，温度15℃-30℃。5.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，干燥过程是静置于80℃烘箱干燥2小时。6.一种如权利要求1-5任一所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测副猪嗜血杆菌细菌的基因组DNA；(2)杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成分，然后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增。所述的反应体系为：5μl5×Buffer，1μl...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文刚，吴凤笋，刘玲玲，吕玉金，赵迪，樊淑华，刘胜利，陈志港，郭敏，李明亮，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：河南,41