一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法技术

本发明专利技术公开了一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，本发明专利技术对PEDV流行毒株（CH/HNQX‑3/14）的部分S1基因（包含499‑638 aa,748‑755 aa和756‑771 aa 3个抗原表位区）进行克隆，构建重组表达质粒pET30a(+)‑pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得可溶性表达的重组pS1蛋白，该蛋白能够与猪的PEDV阳性血清发生特异性反应。以纯化后的重组pS1蛋白作为包被抗原，建立了PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法，该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可应用于PEDV IgA抗体的临床检测及免疫评价。本发明专利技术操作简单，应用范围广。

ELISA method for detecting IgA antibody of porcine epidemic diarrhea virus based on recombinant S1 protein

The invention discloses a ELISA method for detection of recombinant S1 protein of porcine epidemic diarrhea virus IgA antibody based on the invention of PEDV strains (CH/HNQX 3/14) part of S1 gene (including 499 638 AA, 748 AA and 756 755 771 AA 3 epitope region) cloning, recombinant expression plasmid pET30a (+) pS1, transformed into Escherichia coli BL21, obtained by optimizing the expression conditions, the soluble expression of recombinant pS1 protein, the protein to PEDV positive serum and pig specific reaction. The purified recombinant pS1 protein as antigen to establish an indirect ELISA PEDV IgA antibody detection method, this method has good specificity, sensitivity and repeatability, clinical detection and immune evaluation can be applied to PEDV IgA antibody. The invention has simple operation and wide application range.

【技术实现步骤摘要】
一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法
本专利技术涉及检测猪流行性腹泻病毒的方法，特别是一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的肠道传染病。该病已成为制约我国养猪业健康发展的重要猪病之一。作为猪的一种肠道病毒，PEDV引起的免疫应答主要以肠道粘膜免疫为主。实践中，血清学检测仍然是PEDV临床诊断及免疫评价的常用方法。遗憾的是，目前的抗体检测技术主要集中在血液中IgG抗体水平的检测，而临床检测发现，尽管疫苗免疫后血清中存在较高水平的抗PEDVIgG抗体，猪群仍发生腹泻的情况时常发生。因此，传统检测血清中的PEDVIgG抗体水平不能真实反映PEDV疫苗的免疫保护状况。对于肠道病毒来说，IgA是病原体感染后肠道粘膜产生最多的抗体类型，也是阻止病原体入侵肠道的重要防线，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。因此，对于PEDV来说，猪体内IgA水平更能反应机体被PEDV感染情况及疫苗免疫保护效力。目前对于IgA的检测仍存在一定难度，国内尚缺乏标准的PEDVIgA检测技术和产品。
技术实现思路
本专利技术根据流行毒株CH/HNQX-3/14的S1基因序列设计引物，扩增产物编码的蛋白包含了S1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三个中和表位区。将其构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，采用Ni-NTA亲和层析对其进行纯化，以纯化后的重组pS1蛋白为抗原包被酶标板，建立了PEDVIgA抗体间接ELISA检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复度，可用于PEDV的临床检测及疫苗免疫评价。本专利技术的目的是提供一种高通量检测PEDVIgA抗体的ELISA方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，可用于PEDV的疫苗免疫评价。本专利技术的技术方案是，一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，它包括以下步骤：步骤1：重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：(1)pS1重组表达质粒的构建采用上游引物：5'-GGGGATCCTCTTTTGTTACTTTGCC-3’河下游引物：5’-GCGAATTCAGGCGTGTTGTAAAGC-3’扩增pS1基因，上下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，将该基因克隆至pET30a(+)载体，构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1；(2)确定诱导前菌液OD600值诱导前首先测定菌液OD600值，然后加入1.0mMIPTG，置于37℃摇床250rpm诱导表达10h，菌体经8000rpm离心15min后超声破碎；每工作5s，间隔5s，15min，12000rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12﹪SDS-PAGE电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳OD600值为0.6；(3)重组pS1蛋白诱导表达温度的优化菌液培养至以上确定的OD600值时加入1.0mMIPTG，分别置于20℃～37℃摇床250rpm培养10h，菌体经离心及超声破碎处理后，12﹪SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30℃为最佳诱导表达温度；(4)IPTG工作浓度的优化按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2mM的IPTG诱导表达10h，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定IPTG的最佳诱导工作浓度为0.8mM；(5)重组pS1蛋白诱导表达时间的优化根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2h开始，每隔2h收样一次，直到诱导20h结束，超声处理诱导后菌液，12000rpm离心10min，12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8h；步骤2：重组pS1蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化(1)装住：将柱子垂直固定于离心管架子上，取20mL填料加入柱子中，沉积30min；(2)将镍柱接入explorer10蛋白纯化仪，打开BiologicDuoFlow程序；(3)平衡：用至少10倍柱床体积的Bindbuffer(300mMNaCl，50mMNaH2PO4，10mMImidazole，pH8.0)对柱子平衡2次；(4)上样：将待纯化蛋白循环上样3-5次。注意保存流穿过的蛋白液，比较过柱前后目的蛋白的浓度变化；(5)洗涤：用WashingBuffer(300mMNaCl，50mMNaH2PO4，50mMImidazole，pH8.0)反复洗涤杂蛋白，用蛋白指示剂检测蛋白浓度的变化；(6)洗脱：用ElutionBuffer(300mMNaCl，50mMNaH2PO4，200mMImidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE及Western-blot鉴定分析洗脱效果；(7)柱子保存：分别用5-10倍柱体积的Bindingbuffer和超纯水对柱子进行清洗，再加入20﹪乙醇4℃保存；步骤3：pS1-ELISA方法的建立(1)包被：表达的重组pS1蛋白按1.25μg/mL浓度用0.05MCBS(pH9.6)包被于96孔板(50μL/孔)，4℃过夜，取出后用PBST洗涤5次；(2)封闭：每孔加入200μL的1﹪BSA作为封闭液，置于37℃条件下封闭90min，洗涤5次；(3)加样：样品用PBS稀释后按每孔50μL加入酶标板，并加入阴性和阳性对照，37℃作用30min，洗涤5次；(4)加入酶标二抗：山羊抗猪IgA酶标二抗(HRP-IgA)按1:4000倍稀释后，按每孔50μL量加入以上酶标孔，37℃反应30min，洗涤5次；(5)显色与终止：按50μL/孔的量加入TMB显色液，避光条件下显色10min，加入2MH2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450值；(6)结果判定：利用以上方法检测36份PEDV阴性血清，测定OD450值，计算平均值和标准差(SD)，当待检血清且阴性对照OD450nm＜0.12时即可判为阳性，其它判为阴性。最终确定阴、阳性的临界值为0.43。本专利技术至少包括以下有益效果：(1)本装置是一种基于PEDV的重组纤突蛋白(S1蛋白)所建立的ELISA方法。首先根据流行毒株CH/HNQX-3/14的S1基因序列设计引物，扩增产物编码的蛋白包含了S1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三个中和表位区。将其构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，采用Ni-NTA亲和层析对其进行纯化，以纯化后的重组pS1蛋白为抗原包被酶标板，建立了PEDVIgA抗体间接ELISA检测方法。(2)本装置检测特异性强，敏感性高。采用该ELISA方法，在同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤1：重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立构建重组表达质粒pET30a(+)‑pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：（1）pS1重组表达质粒的构建采用上游引物：5'‑ GG

【技术特征摘要】
1.一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤1：重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：（1）pS1重组表达质粒的构建采用上游引物：5'-GGGGATCCTCTTTTGTTACTTTGCC-3’河下游引物：5’-GCGAATTCAGGCGTGTTGTAAAGC-3’扩增pS1基因，上下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，将该基因克隆至pET30a(+)载体，构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1；（2）确定诱导前菌液OD600值诱导前首先测定菌液OD600值，然后加入1.0mMIPTG，置于37℃摇床250rpm诱导表达10h，菌体经8000rpm离心15min后超声破碎；每工作5s，间隔5s，15min，12000rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12﹪SDS-PAGE电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳OD600值为0.6；（3）重组pS1蛋白诱导表达温度的优化菌液培养至以上确定的OD600值时加入1.0mMIPTG，分别置于20℃～37℃摇床250rpm培养10h，菌体经离心及超声破碎处理后，12﹪SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30℃为最佳诱导表达温度；（4）IPTG工作浓度的优化按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2mM的IPTG诱导表达10h，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定IPTG的最佳诱导工作浓度为0.8mM；（5）重组pS1蛋白诱导表达时间的优化根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2h开始，每隔2h收样一次，直到诱导20h结束，超声处理诱导后菌液，12000rpm离心10min，12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8h；步骤2：重组pS1蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化（1）装住：将柱子垂...

【专利技术属性】
技术研发人员：李任峰，田香勤，鲁毅，荆焕芳，李晓晗，韩俊伟，王自良，马金友，柳东阳，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41