一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法技术

本发明专利技术提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，本发明专利技术通过运用透明质酸钠凝胶延长移植后细胞存活时间，同时针对现有追踪细胞方法的局限性，根据人和小鼠GAPDH基因非同源序列设计引物，应用PCR技术进行移植细胞体内追踪，从而提供一种简单、方便、敏感的追踪卵巢局部干细胞存留的方法，因此具有良好的实际应用之价值。

A method of transplantation and tracing of ovarian stem cells in mice

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。干细胞在疾病治疗、组织修复等领域具有极大的发展潜力和临床应用价值，近年来已成为生命科学领域的重要方向之一，受到广泛关注。当组织细胞发生炎症或者受损伤时，干细胞可以作为种子细胞分化为所需细胞，或者通过旁分泌的方式改善局部微环境，从而应用于多种病变引起的器官组织修复。目前干细胞正在应用于多种疾病动物模型的治疗中，其有效性和安全性都有证实，而且干细胞发挥功能的不同机制也不断被发现。在临床研究当中，许多疾病如黄斑退化、脊髓损伤、骨关节炎、心肌梗塞、早衰症、帕金森病等，各国研究人员应用不同干细胞进行了临床治疗相关的探索，显示出良好的安全性和有效性。早发性卵巢功能不全(prematureovarianinsufficiency，POI)是指女性40岁以前出现卵巢功能减退，表现为月经异常(闭经、月经稀发或频发)、促性腺激素水平升高和雌激素降低，并伴有不同程度的围绝经期症状，是女性不孕不育的重要原因之一。POI病因复杂且缺乏有效的治疗手段，严重威胁家庭稳定和社会和谐。干细胞移植为POI的治疗提供了一种新的方法，其中间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是应用最为广泛的一种。动物实验表明，间充质干细胞移植到POI模型小鼠卵巢后定位于卵巢间质，分泌细胞因子如肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素生长因子1(IGF-1)等改善卵巢局部微环境，增加化疗药物或者免疫损伤后的卵巢体积，恢复小鼠动情周期，升高雌激素水平，增加各级卵泡数，最终提高生育能力。并且，国内外均开展了干细胞治疗POI的临床研究，取得了一定的治疗效果。干细胞移植有望成为一种安全有效的治疗POI的方法，具有良好的临床应用前景。虽然干细胞有良好的应用潜能，但是干细胞在体内存活时间短，极大地影响了干细胞移植后疗效的发挥。因此，在临床上亟需寻找提高卵巢干细胞移植后存活的方法。另外，现在常用的移植后干细胞追踪方法包括动物活体成像或组织切片免疫组化染色分析移植细胞的存活情况。这些方法或需要精密的仪器，或只能反映某个切面不能整体反映移植细胞的存活情况，具有一定的局限性。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，本专利技术通过运用透明质酸钠凝胶延长移植后细胞存活时间，同时针对现有追踪细胞方法的局限性，根据人和小鼠GAPDH基因非同源序列设计引物，应用PCR技术进行移植细胞体内追踪，从而提供一种简单、方便、敏感的追踪卵巢局部干细胞存留的方法，因此具有良好的实际应用之价值。本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术的第一个方面，提供透明质酸钠凝胶在小鼠卵巢干细胞移植及追踪中的应用。本专利技术研究发现，透明质酸钠对于延长干细胞在卵巢局部存留有良好效果。进一步的，所述透明质酸钠凝胶浓度为0.1～0.3mg/ml(优选为0.3mg/ml)。进一步的，所述干细胞为人脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，UCMSCs)。本专利技术的第二个方面，提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，所述方法包括：将人脐带间充质干细胞重悬于透明质酸钠凝胶溶液中，移植至小鼠卵巢中；通过比对人和小鼠GAPDH基因DNA序列不同之处，在非同源的位置设计人GAPDH(hGAPDH)引物以及小鼠Gapdh(mGapdh)引物，检测基因扩增产物，追踪干细胞移植后不同时间点小鼠卵巢内人脐带间充质干细胞的存留。进一步的，所述透明质酸钠凝胶溶液中采用PBS作为溶剂；进一步的，所述透明质酸钠凝胶溶液中透明质酸钠凝胶浓度为0.1～0.3mg/ml(优选为0.3mg/ml)；透明质酸钠凝胶浓度过低，则对干细胞在卵巢局部存留时间提升效果不明显；透明质酸钠凝胶浓度过高，则透明质酸钠凝胶过于粘稠，不利于注射操作，且可能对干细胞的生物学性质产生影响。进一步的，所述人脐带间充质干细胞移植细胞量为0.1～5x105(优选为1x105)；进一步的，所述移植采用微量注射器卵巢局部注射的方式进行。进一步的，所述人GAPDH(hGAPDH)引物为：F:5'-GCACCCTATGGACACGCTC-3'(SEQIDNO.1)；R:5'-CCCACATCACCCCTCTACCTC-3'(SEQIDNO.2)；进一步的，所述小鼠Gapdh(mGapdh)引物为：F:5'-GTCACTACCGAAGAACAACGAG-3'(SEQIDNO.3)；R：5'-TGTGGGCTCCGAACTGAT-3'(SEQIDNO.4)。本专利技术有益效果：本专利技术提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，本专利技术经过研究发现，通过添加适宜浓度的透明质酸钠凝胶能够显著延长移植后细胞存活时间，而且适宜浓度的透明质酸钠对体外培养干细胞的生物学性质等不产生显著影响；同时针对现有追踪细胞方法的局限性，本专利技术根据人和小鼠GAPDH基因非同源序列设计引物，扩增基因产物，从而利用PCR技术对移植的人脐带间充质干细胞进行体内追踪，该方法简单、方便、灵敏度高，因此具有良好的实际应用之价值。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为实施例一中用于干细胞追踪的PCR引物验证图。不同数量干细胞与卵巢混合后提取总DNA，PCR扩增人源GAPDH和鼠源Gapdh基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。hGAPDH代表人GAPDH，mGapdh代表小鼠Gapdh。结果表明随着干细胞数量的增加，hGAPDH条带逐渐变深变亮，mGapdh随着细胞数量增加有减少的趋势。阳性及阴性对照分别显示hGAPDH引物不能扩增小鼠卵巢DNA序列，同时mGapdh引物不能扩增人UCMSCsDNA序列，证明这两对引物可以用于干细胞移植后的追踪。图2为实施例四中探索合适的细胞移植数量图。不同数量的干细胞对小鼠进行卵巢原位移植，1天后取卵巢，检测存活在卵巢中的干细胞。图为提取卵巢DNA，PCR后琼脂糖凝胶电泳检测hGAPDH基因。结果显示，1x105/5μl效果较好，加大移植细胞量并没有明显改善。图3为实施例五中探索合适的透明质酸钠凝胶浓度图。0～0.3mg/ml透明质酸钠凝胶与1x105细胞混合后进行卵巢局部移植，1天后取卵巢提DNA，检测hGAPDH基因。结果显示，与其它浓度相比，0.3mg/ml透明质酸钠凝胶(HA)对于细胞移植效果最好，更高浓度的透明质酸钠凝胶由于堵塞注射器针头而无法移植。图4为实施例六中应用透明质酸钠凝胶移植延长干细胞在小鼠卵巢内的存留时间图。1x105/5μl干细胞移植后第1，3，7，14天取卵巢提DNA，进行PCR。图为PCR后琼脂糖凝胶电泳检测不同时间点小鼠卵巢中存留的人GAPDH基因。结果显示，与MSC组相比，MSC+0.3mg/mlHA组每个时间点都有更多的存留细胞，而且在7天也检测到了存活的细胞，证明HA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.透明质酸钠凝胶在小鼠卵巢干细胞移植及追踪中的应用。

【技术特征摘要】
1.透明质酸钠凝胶在小鼠卵巢干细胞移植及追踪中的应用。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述透明质酸钠凝胶浓度为0.1～0.3mg/ml(优选为0.3mg/ml)。3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述干细胞为人脐带间充质干细胞。4.一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，其特征在于，所述方法包括：将人脐带间充质干细胞重悬于透明质酸钠凝胶溶液中，移植至小鼠卵巢中；通过比对人和小鼠GAPDH基因DNA序列不同之处，在非同源的位置设计人GAPDH引物以及小鼠Gapdh引物，检测基因扩增产物，用来追踪干细胞移植后不同时间点小鼠卵巢内人脐带间充质干细胞的存留。5.如权利要求4所述的一种方法，其特征在于，所述透明质酸钠凝胶溶液中采用PBS作为溶剂。6.如权利要求4所述的一种方法，其特征在于，所述透明质酸钠凝胶溶液中透明质酸钠...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵世斗，焦文林，秦莹莹，陈子江，颜磊，刘冉，燕涛，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37