本发明专利技术公开了一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，包括步骤一，模板的制备；步骤二，引物的合成与准备；步骤三，结果的判定；模板的制备包括以下步骤：用清水漱口后，采集口腔脱落细胞，采集时将口腔脱落细胞采集拭子伸进口腔壁，紧靠脸颊内侧上下刮拭30～40次；用1mL TE将细胞涮洗下来，进行离心分层；弃上清，沉淀用50μL TE重悬，即可作为模板；准备PCR引物序列：设定PCR体系和PCR程序根据熔解曲线的峰型判定基因型；该基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，采用单步分析方法，细胞采集后直接进行分析，无需核酸提取，步骤简单，且对照与目标基因的分析单管内就可以实现，减少实验步骤及成本，且荧光通道只要一个，对设备要求低。
A Detection Method of GSTM1 Gene Deletion Based on Melting Curve Analysis
【技术实现步骤摘要】
一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法
本专利技术涉及基因缺失检测方法
，具体为一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法。
技术介绍
谷胱甘肽转移酶(GSTs)是一种重要的酶家族，它催化多种外源性物质的解毒，包括环境致癌物、化疗药物和活性氧。它们参与第二阶段的解毒，介导还原型谷胱甘肽与亲电化合物的偶联，从而消除有毒化合物。因此，GSTs在保护细胞免受环境暴露和氧化应激中发挥重要作用，并与细胞对药物的耐药性有关。GSTM1是GSTs家族中重要的一员，它有一个常见的多态性的特点是完全缺失基因。2个纯合缺失(无基因型)导致酶及其催化活性的缺失，这已被证明会降低细胞对某些毒性物质的解毒能力。GSTM1的缺失基因型，被认为是一些与外源性物质相关疾病易感性的关键因素，如肺癌、鼻咽癌等。此外，GSTM1的缺失基因型也被认为与铂类、奈韦拉平、氯氮平等药物的疗效及副作用有关。目前应用最广泛的基因缺失分型方法是传统的多重PCR加凝胶电泳分析、taqman探针法和芯片法。传统的多重PCR加凝胶电泳分析，步骤繁琐，不适用中高通量的样本分析。Taqman探针法往往需要两个荧光通道以上的实时PCR仪，对仪器要求较高，且探针合成较贵。芯片法需要专门的仪器与耗材，步骤繁琐，价格昂贵，对少数几个基因的分型并不合适。因此设计一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法是十分有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，包括步骤一，模板的制备；步骤二，引物的合成与准备；步骤三，结果的判定；其中在上述步骤一中，模板的制备包括以下步骤：1)用清水漱口后，采集口腔脱落细胞；2)用1mLTE将细胞涮洗下来，进行离心分层；3)弃上清，沉淀用50μLTE重悬，即可作为模板；其中在上述步骤二中，引物的合成与准备包括以下步骤：1)PCR引物序列：①GSTM1-FGAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC；②GSTM1-RGTTGGGCTCAAATATACGGTGG；③BCL2-FGCAATTCCGCATTTAATTCATGG；④BCL2-RGAAACAGGCCACGTAAAGCAAC；2)PCR体系：①5ul的TalentqPCRPremix反应液2个；②2ul的引物混合液；③1ul的模板；④2ul的水；3)PCR程序：①95℃，10min；②95℃，5s，63℃，25s，72℃，20s，38个循环；③95℃，10s；65℃，60s；温度缓慢且匀速的升至98℃，每摄氏度采集五个数据点；其中在上述步骤三中，根据熔解曲线的峰型判定基因型。根据上述技术方案，所述步骤一1)中，采集时将口腔脱落细胞采集拭子伸进口腔壁，紧靠脸颊内侧上下刮拭30～40次。根据上述技术方案，所述步骤一2)中，离心速度为4000r/min，离心5min。根据上述技术方案，所述步骤二2)中，TalentqPCRPremix反应液的型号为FP209。根据上述技术方案，所述步骤二3)中，升温速度为0.2℃/s。根据上述技术方案，所述步骤三中，峰型判定包括：1)仅在位置1出现峰，缺失型；2)在位置1和2出现峰，正常型；3)在位置1未出现峰，实验出错，需复核。与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：该基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，采用单步分析方法，细胞采集后直接进行分析，无需核酸提取，步骤简单，且对照与目标基因的分析单管内就可以实现，减少实验步骤及成本，且荧光通道只要一个，对设备要求低。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是本专利技术的立流程图；图2是本专利技术的正常型熔解曲线示意图；图3是本专利技术的缺失型熔解曲线示意图；图中：1、位置1；2、位置2。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1-3，本专利技术提供一种技术方案：一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，包括以下步骤：1)模板的制备：用清水漱口后，采集口腔脱落细胞，采集时将口腔脱落细胞采集拭子伸进口腔壁，紧靠脸颊内侧上下刮拭30～40次；用1mLTE将细胞涮洗下来，进行离心分层，离心速度为4000r/min，离心5min；弃上清，沉淀用50μLTE重悬，即可作为模板；2)引物的合成与准备：PCR引物序列：GSTM1-FGAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC；GSTM1-RGTTGGGCTCAAATATACGGTGG；BCL2-FGCAATTCCGCATTTAATTCATGG；BCL2-RGAAACAGGCCACGTAAAGCAAC；PCR体系：5ul的TalentqPCRPremix反应液2个，TalentqPCRPremix反应液的型号为FP209；2ul的引物混合液；1ul的模板；2ul的水；PCR程序：95℃，10min；95℃，5s，63℃，25s，72℃，20s，38个循环；95℃，10s；65℃，60s；温度缓慢且匀速的升至98℃，升温速度为0.2℃/s，每摄氏度采集五个数据点；3)结果的判定：根据熔解曲线的峰型判定基因型，峰型判定包括：①仅在位置1出现峰，缺失型；②在位置1和2出现峰，正常型；③在位置1未出现峰，实验出错，需复核。本专利技术与常规方法(PCR+琼脂糖凝胶电泳)的比较：205个样本分别本专利技术和常规PCR凝胶电泳进行GSTM1的分析，比较结果如下表。注：*这2个样本用第三种方法分析为缺失型；这5个样本用第三种方法分析为正常型。本专利技术实验失败的仅1％，而常规法达5.9％。采用本专利技术可使实验失败率显著降低(P值<0.01)。验证分析表明,92例常规分析结果为正常型的，本专利技术分析正常型例数为90例，吻合率97.8％，有差异的2例用第三种方法验证，也为缺失型。表明，本专利技术对于正常型的准确率为100％，常规方法为97.8％。验证分析表明,101例常规分析结果为缺失型的，本专利技术分析缺失型例数为95例，吻合率94％，有差异的5例用第三种方法验证，也为正常型。表明，本专利技术对于缺失型的准确率为100％，常规方法为94％，假阳性率显著降低(P值<0.01)综上所诉，本专利技术由于操作步骤少，检测荧光更灵敏，相比较传统方法，实验失败率显著降低，对缺失型的检测准确率升高，假阳性率下降。需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，包括步骤一，模板的制备；步骤二，引物的合成与准备；步骤三，结果的判定；其特征在于：其中在上述步骤一中，模板的制备包括以下步骤：1)用清水漱口后，采集口腔脱落细胞；2)用1mL TE将细胞涮洗下来，进行离心分层；3)弃上清，沉淀用50μL TE重悬，即可作为模板；其中在上述步骤二中，引物的合成与准备包括以下步骤：1)PCR引物序列：①GSTM1‑F GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC；②GSTM1‑R GTTGGGCTCAAATATACGGTGG；③BCL2‑F GCAATTCCGCATTTAATTCATGG；④BCL2‑R GAAACAGGCCACGTAAAGCAAC；2)PCR体系：①5ul的Talent qPCR Premix反应液2个；②2ul的引物混合液；③1ul的模板；④2ul的水；3)PCR程序：①95℃，10min；②95℃，5s，63℃，25s，72℃，20s，38个循环；③95℃，10s；65℃，60s；温度缓慢且匀速的升至98℃，每摄氏度采集五个数据点；其中在上述步骤三中，根据熔解曲线的峰型判定基因型。
【技术特征摘要】
1.一种基于熔解曲线分析的GSTM1基因缺失检测方法，包括步骤一，模板的制备；步骤二，引物的合成与准备；步骤三，结果的判定；其特征在于：其中在上述步骤一中，模板的制备包括以下步骤：1)用清水漱口后，采集口腔脱落细胞；2)用1mLTE将细胞涮洗下来，进行离心分层；3)弃上清，沉淀用50μLTE重悬，即可作为模板；其中在上述步骤二中，引物的合成与准备包括以下步骤：1)PCR引物序列：①GSTM1-FGAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC；②GSTM1-RGTTGGGCTCAAATATACGGTGG；③BCL2-FGCAATTCCGCATTTAATTCATGG；④BCL2-RGAAACAGGCCACGTAAAGCAAC；2)PCR体系：①5ul的TalentqPCRPremix反应液2个；②2ul的引物混合液；③1ul的模板；④2ul的水；3)PCR程序：①95℃，10min；②95℃，5s，63℃，25s，72℃，20s，38个循环；③95℃，10s；65℃，60s；温度缓慢且匀速的升至98℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄拔严，张彦伟，
申请(专利权)人：北京益序医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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