一种适用条件宽泛的检测多黏菌素耐药基因的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种适用条件宽泛的检测多黏菌素耐药基因的检测方法，材料准备包括菌株与质粒、试剂、PCR仪准备；引物设计，DNA模板制备，多重PCR反应体系及程序，最后进行PCR产物测序。本发明专利技术的有益效果是节省检测时间，减少工作、节省费用，且操作简便，适合临场和研究检测用。

A method for detecting polymyxin resistance genes with wide application conditions

【技术实现步骤摘要】
一种适用条件宽泛的检测多黏菌素耐药基因的检测方法
本专利技术属于基因检测
，涉及一种多黏菌素耐药基因mcr-1～5多重PCR聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)引物及检测方法。
技术介绍
抗生素的发现和应用给人类及动物的健康带来了保障，目前仍旧是治疗细菌感染最有效手段。但随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，世界卫生组织将细菌耐药性列为21世纪人类健康最大威胁之一。近年来多重耐药菌、泛耐药菌，尤其是“超级细菌”的出现导致抗生素疗效急剧降低，加剧了感染疾病的死亡率，迫使人类进入“后抗生素时代”，即无药可用的窘境。多黏菌素类抗生素具有良好的治疗碳青霉烯类耐药菌感染的作用，一度被视为感染治疗的“最后一道防线”。但近年来，随着多黏菌素作为临床及饲料添加剂被广泛使用，其耐药性日益显现；尤其是2016年在我国发现的多黏菌素耐药基因mcr-1的发现，进一步加剧了多黏菌素耐药菌的传播和流行。mcr-1基因不同于染色体介导的耐药基因，它具有可转移性，能够介导多黏菌素耐药快速传播，尤其是跨菌属传播。mcr-1一经报道，便引起了世界广泛关注，各国也投入了大量精力进行研究。为了保障多黏菌素在人类临床仍旧可用，缓解多黏菌素耐药性，各国相继出台了多黏菌素的使用政策，我国也禁止了多黏菌素作为饲料添加剂应用于养殖业。但mcr仍旧不断的传播和流行，在动物、人医、环境等环节均有发现，而mcr基因可以通过多种途径进入通过多种途径(包括医院和废水处理厂的排污，人和动物的粪尿排泄，以及用于土壤灌溉的养殖场粪肥)进入到环境中，造成生态环境的破坏。mcr基因可通过接合转移、自然转化或者借助各种水平转移元件等多种方式进行水平转移，在某些情况下即使在无抗压力下也能持续存在，并难以消除，已经成为“新型污染物”，成为大家关注的焦点和研究的热点，同时多重耐药致病菌在食品动物、动物性食品及相关环境中的流行，不仅危害食品安全，还对人类健康的造成巨大威胁。因此，如何快速高效地检测与控制这类新型污染物，已成为了当前迫切的需要，对保障食品安全和维护人类健康具有很重要的意义。更令人遗憾的是mcr-1正在进化，目前已出现多种变异体mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5。PCR是检测mcr基因最为灵敏、高效、廉价的方法，传统PCR仅能检测一种mcr变体型；如果进行同一样品多基因型检测，需要进行多次试验，不仅费时费力、耗物耗资、程序繁琐，同时还对样品具有较高的质量要求，抗噪能力差，灵敏度低，分辨率不高，特异性差。因此需要设计和制备能够一次性检测mcr-1～5的多重PCR。尽管目前已有两篇报道设计了两组引物，但这两组设计的缺陷存在于仅能对单一mcr基因型进行检测，灵敏度差，难以做到同一PCR中检测多个mcr变异型，且分辨率高。因此本项目旨在建立一种灵敏度高、特异性好、分辨率高的mcr-1～5检测多重PCR。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测多黏菌素耐药基因的检测方法，本专利技术的有益效果是能完成单一样品中mcr多基因的检测，特点是能通过不同条带大小区分确定基因亚型，克服了单一样品中无法多基因检测及无法区分的问题，且该方法因设计时采用了200bp(多数在300bp)左右的间隔，比同类方法具有更好的分辨率；且该方法适用于商业化DNA聚合酶，克服了已有mcr多重PCR方法必须采用临场配制的PCR缓冲条件。该方法节省检测时间，减少工作、节省费用，且操作简便，适合临场和研究检测用。本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：材料：菌株与质粒：基因重组构建pBAD质粒上的mcr-2、mcr-4的大肠杆菌，选取mcr-1、mcr-3、mcr-5临床菌株以及检测所用菌株均申请单位提供；试剂：DNA分子标准量Marker购博迈德生物技术有限公司；2×TaqMasterMix诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GoldView染料购自北京金迈森生物科技有限公司；主要仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪；(一)引物设计采用primerpremier5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性；(二)DNA模板制备将携带mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2mL含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃的条件下200rpm摇培，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA；(三)多重PCR反应体系及程序1、PCR反应体系：2μL水煮或试剂盒提取的DNA为模板，引物1μL，2×TaqMasterMixDNA聚合酶12.5μL，用蒸馏水补足25uL；可按照相应比例扩大到50μL体系；2、PCR反应条件：预变性94℃，时间3min；变性94℃，时间30s；退火56℃，时间30s；延伸72℃，时间1min；最后延伸3min；(四)PCR产物测序PCR产物凝胶电泳检测：配制1.2％凝胶块，120V电压，电泳时间20分钟，凝胶成像。进一步，引物如下：AMCR1-MF：ATCAGCCAAACCTATCCTATCG，AMCR1-MR：ATAGATGTTGCTGTGCGTCTGC，用来检测mcr-1；AMCR2-MF：GCGTAGGCGGTCTAACATGTAT，AMCR2-MR：GCTGACACCTCTTGTCATTGCA，用来检测mcr-2；AMCR3-MF：TATGGGTTACTATTGCTGG，AMCR3-MR：CGATGAGCATCAGGGTAG，用来检测mcr-3；AMCR4-MF：GTCATAGTGGTCGAAAAGTACAG，AMCR4-MR：GTTGGCTCTGATAGACGGTGG，用来检测mcr-4；AMCR5-MF：GCGGTTGTCTGCATTTATCAC，AMCR5-MR：TGCCGAAGACAGGTTATCAAAG，用来检测mcr-5。附图说明图1为检测结果示意图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术能同时检测mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5多基因的引物组，如表1所示包括以下5组引物：表1mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5多黏菌素耐药基因检测方法：材料：菌株与质粒基因重组构建pBAD质粒上的mcr-2、mcr-4的大肠杆菌，选取mcr-1、mcr-3、mcr-5临床菌株以及检测所用菌株均申请单位提供。主要试剂DNA分子标准量Marker购博迈德生物技术有限公司；2×TaqMasterMix诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GoldView染料购自北京金迈森生物科技有限公司。主要仪器：恒温振荡培养箱、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪。(一)引物设计采用primerpremier5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性，序列见表1；引物由博迈德生物科技有限公司合成。(二)DNA模板制备将携带mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2mL含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用条件宽泛的检测多黏菌素耐药基因的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：材料：(1)菌株与质粒基因重组构建pBAD质粒上的mcr‑2、mcr‑4的大肠杆菌，选取mcr‑1、mcr‑3、mcr‑5临床菌株以及检测所用菌株均申请单位提供；(2)试剂MHA培养基；DNA分子标准量Marker购博迈德生物技术有限公司；2×Taq Master Mix诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GoldView染料购自北京金迈森生物科技有限公司；(3)主要仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪；(一)引物设计采用primer premier 5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性；(二)DNA模板制备将携带mcr‑1、mcr‑2、mcr‑3、mcr‑4、mcr‑5菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2ml含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃的条件下200rpm，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA；(三)多重PCR反应体系及程序1、PCR反应体系：2μL水煮或试剂盒提取的DNA为模板，引物1μL，2×Taq DNA聚合酶12.5μL，用蒸馏水补足25μL；2、PCR反应条件：预变性94℃，时间3min；变性94℃，时间30s；退火56℃，时间30s；延伸72℃，时间1min；最后延伸3min；(四)PCR产物测序PCR产物凝胶电泳检测：配制1.2％凝胶块，120V电压，电泳时间20分钟，凝胶成像。...

【技术特征摘要】
1.一种适用条件宽泛的检测多黏菌素耐药基因的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：材料：(1)菌株与质粒基因重组构建pBAD质粒上的mcr-2、mcr-4的大肠杆菌，选取mcr-1、mcr-3、mcr-5临床菌株以及检测所用菌株均申请单位提供；(2)试剂MHA培养基；DNA分子标准量Marker购博迈德生物技术有限公司；2×TaqMasterMix诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GoldView染料购自北京金迈森生物科技有限公司；(3)主要仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪；(一)引物设计采用primerpremier5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性；(二)DNA模板制备将携带mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2ml含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃的条件下200rpm，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA；(三)多重PCR反应体系及程序1、PCR反应体系：2μL水煮或试剂盒提取的DNA为模板，引物1μL，2×TaqDNA聚合酶12.5μL，用蒸馏水补足25μL；2...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪洋，刘志海，翟卫帅，刘德俊，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11