一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法，本方法一对用于重叠延伸PCR的全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明专利技术通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行Sanger测序分析，利用本发明专利技术可以将任意的2～4个包含各自检测位点的片段拼接连接形成融合片段，快速、简单，不需要限制性内切酶，中间无任何非目的基因的DNA序列，进而检测的检测突破了Sanger测序读长的限制，可以通过一个Sanger测序反应同时检测多个不连续的DNA位点。

A Method for Detecting Discontinuous Multiple DNA Loci by Overlapping Extended Polymerase Chain and Sanger Sequencing

【技术实现步骤摘要】
一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法
本专利技术涉及基因检测
，更具体地，涉及一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法。
技术介绍
一代测序技术是20世纪70年代中期由FredSanger及其同事首先专利技术。其基本原理是利用双脱氧核糖核苷酸在脱氧核糖碳骨架上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，用双脱氧核糖核苷酸当作链终止试剂，测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物，延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP(双脱氧核糖核苷酸并标记不同的荧光标记)中的一种来进行终止，最终产生一系列大小不同的分子，读取这些分子荧光信号的类别和顺序即可获得序列信息。因此一代测序技术由于其准确性好，操作越来越简便等优势，已在遗传病或者肿瘤等方面的检测得到非常广泛的应用。另一方面，由于测序成本相对较高，且测序长度在800bp左右，因此在检测不连续多位点或者多个相隔较远的位点时，往往需要分开单独扩增各个位点，并分开测序，造成成本和操作复杂度的增加。重叠延伸PCR技术(splicingbyoverlappingextensionPCR，SOEPCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的新技术(图1)。该技术可以快速获取依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOEPCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。此技术可以将任意的两个目的基因拼接连接形成2个目的基因的融合基因，中间无任何非目的基因的DNA序列，这样就避免因加入连接序列可能出现的非目的基因序列，从而在体外就可得到高质量的目的基因序列。目前的重叠延伸PCR技术，一般包括两次PCR反应，第一次PCR形成具有重叠区域的DNA片段，回收产物；在第二次PCR中，将第一轮PCR的回收产物具有重叠区域的位置互补结合，由两侧的引物共同引导目的DNA片段的合成，不需要限制性内切酶即可以进行片段连接。至今为止，市场上用于一代测序的技术，尚未出现一种复合定向延伸多DNA片段并测序的PCR技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种测序检测不连续多位点的方法。本专利技术的第一个目的是一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物。本专利技术的第二个目的是一种用于重叠延伸PCR的引物组合。本专利技术的第三个目的是所述引物或所述引物组合在多DNA片段PCR扩增、多DNA片段PCR扩增试剂盒、多DNA片段位点检测或多DNA片段位点检测试剂盒中的应用。本专利技术的第四个目的是一种多DNA片段PCR扩增的方法。本专利技术的第五个目的是一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒。本专利技术的第六个目的是一种多DNA片段位点检测的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利在原有重叠延伸PCR技术的基础上进行进一步的改进，使得仅仅通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行测序分析。在本专利技术中PCR包括两个阶段，第一阶段是各个位点所在的片段的扩增；第二阶段是通过各单独片段R端与F端引物区的重叠区域互补结合延伸，从而获得完整地长片段。关键点是两轮PCR反应采用Tm值相差3～8℃的嵌合引物对。一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。SEQIDNo.1：5′-CTGCATAGTCTACTGGATCAAC-3′；SEQIDNo.2：5′-GATCGTCAGTGCTCACTACATC-3′。一种用于重叠延伸PCR的引物组合，包括所述的通用全长扩增引物和扩增各目的片段的片段扩增引物；最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQIDNo.1所示序列，其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQIDNo.2所示序列；其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物；其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要求1所述引物Tm值相差3～8℃。其中，Tm值相差的具体数值，其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物与其上游的目的片段3’端的碱基的重叠的数量，都是以及根据具体扩增的片段进行调整和优化。优选地，所述常规上游引物和常规下游引物与核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示引物Tm值相差3～8℃。所述引物或所述引物组合在多DNA片段PCR扩增、多DNA片段PCR扩增试剂盒、多DNA片段位点检测或多DNA片段位点检测试剂盒中的应用，也属于本专利技术的保护范围。一种多DNA片段PCR扩增的方法，利用所述引物进行PCR扩增。优选地，所述引物进行PCR扩增。一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒，包括所述引物。优选地，包括利用所述引物组合。优选地，还包括PCR反应的试剂：GeneAmpTM10×PCRBufferI(ABITM4379876)、25mMMg2+、25mMdNTPs、RocheTaq酶(货号：03501221190)、H2O。优选地，PCR扩增的体系为：GeneAmpTM10×PCRBufferI3μl，25mMMg2+2.5μl，25mMdNTPs0.3μl，每条引物各1μl，RocheTaq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl。优选地，PCR扩增的程序为：95℃9min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min；16℃∞。优选地，扩增产物的测序引物与通用的通用全长扩增的引物相同，或扩增产物的测序引物为通用全长扩增的引物的一段。所述引物作为所述引物或/和所述引物组合的扩增产物的测序引物的应用，也属于本专利技术的保护范围。一种多DNA片段位点检测的方法，所述方法进行多DNA片段PCR扩增后，用核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示引物进行的Sanger测序。优选地，所述Sanger测序的试剂为BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit。更优选地，所述Sanger测序的PCR反应的体系为：BigDye0.5μl；5×seqBuffer1.75μl；引物各1μl；模板1μl；水补足10μl。优选地，所述Sanger测序的PCR反应的程序为：96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环；4℃∞。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行Sanger测序分析，利用本专利技术可以将任意的2～4个包含各自检测位点的片段拼接连接形成融合片段，快速、简单，不需要限制性内切酶，中间无任何非目的基因的DNA序列，进而检测的检测突破了Sanger测序读长的限制，可以通过一个Sanger测序反应同时检测多个不连续的DNA位点。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。

【技术特征摘要】
1.一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。2.一种用于重叠延伸PCR的引物组合，其特征在于，包括权利要求1所述的通用全长扩增引物和扩增各目的片段的片段扩增引物；最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQIDNo.1所示序列，其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQIDNo.2所示序列；其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物的，其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要1所述引物Tm值相差3～8℃。3.权利要求1所述引物或权利要求2所述引物组合在多DNA片段PCR扩增、多DNA片段PCR扩增试剂盒、多DNA片段位点检测或多DNA片段位点检测试剂盒中的应用。4.一种多DNA片段PCR扩增的方法，其特征在于，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑焱，陈佩璇，卢炫廷，邱美兰，谢龙旭，邱雪莲，吴丹叶，徐爱娟，
申请(专利权)人：广州凯普医药科技有限公司，广州凯普医学检验所有限公司，广州凯普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44