【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测，具体地，涉及一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。
技术介绍
1、地中海贫血是一组以一个或多个血红蛋白（hb）链合成缺陷为特征的异质性遗传病，这会导致不稳定的非地中海血型hb链的积累，从而沉淀并导致外周血中红系前体细胞的髓内破坏和红细胞的过早溶解。地中海贫血主要可分为：α-地中海贫血，α珠蛋白亚基生成缺失或减少；β-地中海贫血，β珠蛋白链产生缺失或减少；δβ-地中海贫血，δ珠蛋白和β珠蛋白亚基的产生减少或不存在。
2、正常人类受试者有两对α珠蛋白基因和一个αα/αα基因型。与之相反，在α-地中海贫血中，受影响的染色体可能会缺失一个或两个基因。总体而言，2种主要的原因会导致α-地中海贫血：
3、（1）单个α珠蛋白基因缺失，定义为α+-地中海贫血。常见的两种α+-地中海贫血是-α3.7型和-α4.2型，导致α链产生减少。一个（-α/αα）或两个（--/αα，-α/-α）α珠蛋白等位基因的缺失都会导致无症状的α-地中海贫血，这些疾病的特征是α和非α珠蛋白链合成之间的不平衡，导致红细胞参数的轻度至中度变化。
4、（2）一条染色体上的α珠蛋白基因簇（包括两个α等位基因）全部或部分缺失会导致α0-地中海贫血。α样珠蛋白基因（即hbz（ζ-珠蛋白）、hba2（α2-珠蛋白）和hba1（α1-珠蛋白））失活导致过多的β-珠蛋白链产生，在出生后形成β4四聚体（hbh）。从遗传学的角度来看，这些个体是由α+和α0突变的复合杂合性（--/-α）所致。hbh变
5、根据突变和缺失的大小和/或位置，β-地中海贫血可分为以下几种：β0-地中海贫血、δβ-地中海贫血、遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症（hpfh）、γδβ-地中海贫血和εγδβ-地中海贫血。绝大多数β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因点突变或其相邻侧翼区域引起的，β-珠蛋白基因上游的部分缺失相对较少。
6、β肽链基因上不同位点突变会导致β肽链合成量不同，将那些突变使得β肽链减少但并非完全缺失的定义为β+，若突变导致β肽链完全不合成，则定义为β0。其中，若有一个正常β基因，无论突变的基因是β0还是β+，一般为轻型β-地中海贫血，血常规和血红蛋白有异常，但对于携带者的生活影响较少。在杂合子β基因突变中，地中海贫血中cd53这个突变由于发生了移码突变，使得红细胞非常不稳定，其杂合子患者可导致中间型地中海贫血，其对于患者生活有一定影响。而纯合子突变，即两个β基因都有突变的地中海贫血患者多半为中间型或者重型地中海贫血。中间型β-地中海贫血患者由于基因突变类型不同，其贫血程度也有所不同。
7、当夫妇双方均为同一类型（α-或β-）地中海贫血基因携带者时，其后代有四分之一的机会罹患重型α-或β-地中海贫血。通过地中海贫血筛查和诊断，防止重型地贫患儿的出生是必要的措施。通过血常规、血红蛋白电泳分析以及基因诊断来筛查孕育夫妇生育重型地贫患儿的可能性，最后通过对胎儿进行产前诊断，确认为重型地贫患儿则终止妊娠。
8、目前，临床上常用亚能生物技术（深圳）有限公司以及达安基因提供gap-pcr法联合pcr-反向点杂交法检测α-地中海贫血，该方法在α-地中海贫血的分子筛查和临床诊断中发挥了很大的作用，但该方法在对pcr扩增产物分析时容易造成dna交叉污染，而且操作繁琐不适用于大规模检测。近年来，具有高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等特点的微阵列芯片法被应用于α-地中海贫血检测。博奥生物集团有限公司的微阵列芯片法在α-地中海贫血检测中可同时检测缺失型和非缺失型，减少了实验步骤，提高了工作效率，同时可实现连续化和自动化，能满足大规模检测需求。但是，微阵列芯片法容易造成漏检，不能检出泰国型缺失，而泰国型缺失复合东南亚型缺失的双杂合子表型为典型的巴氏水肿胎，因此泰国型缺失的检出意义尤为重要，上述问题使得该检测方法存在比较明显的不足之处；另外，该方法对设备要求较高，试剂成本也较高。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是现有技术中存在的上述缺陷与不足，提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物。
3、本专利技术的第二个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物。
4、本专利技术的第三个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物。
5、本专利技术的第四个目的是提供上述的扩增引物、延伸引物和/或组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
6、本专利技术的第五个目的是提供一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒。
7、本专利技术的第六个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的反应体系。
8、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
9、本专利技术针对地中海贫血症常见突变位点的序列设计基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物和延伸引物，并建立了检测方法：提取全血基因组dna后，通过多重pcr反应、sap反应和单碱基延伸（uep）反应得到反应产物，采用飞行时间质谱仪进行分析。检测结果用typer 4.0软件自动分析，并将各位点峰面积导出至excel文件。根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，snr≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其他情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。
10、因此，本专利技术要求保护以下内容：
11、一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1～10所示。
12、一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列如seq id no.11～40所示。
13、一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物，所述组合物包含上述的扩增引物和延伸引物。
14、优选地，所述组合物能够实现在多重pcr和单碱基延伸反应中，在同一反应体系（单管反应）中对地中海贫血症的相关基因突变进行扩增和单碱基延伸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示。
2. 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物，其特征在于，所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示。
3.一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的扩增引物和权利要求2所述的延伸引物。
4.权利要求1所述的扩增引物、权利要求2所述的延伸引物和/或权利要求3所述的组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
5.一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的扩增引物和/或权利要求2所述的延伸引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含多重PCR检测试剂、SAP反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。
7.一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的反应体系，其特征在于，
8. 根据权利要求7所述的反应体系，其特征在于，所述扩增体系中，核苷酸序列如SEQID NO.1～10所示的各条扩增引物的浓度为0.1～0.2 μM；
9. 根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述扩增体系中，核苷酸序列如SEQID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM、0.1 μM；
10.根据权利要求7～9任一所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包含多重PCR检测试剂、SAP反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。
...【技术特征摘要】
1. 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1～10所示。
2. 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物，其特征在于，所述延伸引物的核苷酸序列如seq id no.11～40所示。
3.一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的扩增引物和权利要求2所述的延伸引物。
4.权利要求1所述的扩增引物、权利要求2所述的延伸引物和/或权利要求3所述的组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
5.一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的扩增引物和/或权利要求2所述的延伸引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：江健钊，孔琪，董丛丛，谢龙旭，赵京州，
申请(专利权)人：广州凯普医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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