基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法及试剂盒。以金属钌配合物作为荧光染料进行PCR反应的闭管目视比色检测，结果显示，在PCR反应扩增的目标DNA存在的情况下扩增体系显示红色，不存在则无色，并且与SYBR Green I和EvaGreen相比，金属钌配合物作为荧光染料可以产生更加明显的颜色对比，使PCR的检测具有直观、省时、便捷、低成本的优点。

Detection of Ruthenium Complexes by PCR Fluorescence Visual Colorimetry and Kit

【技术实现步骤摘要】
基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法及试剂盒
本专利技术涉及聚合酶链式反应(PCR)的检测，具体涉及在PCR反应体系中采用具有核酸分子“光开关”行为的金属钌配合物作为荧光结合染料进行可视化荧光快速检测的方法。
技术介绍
荧光染料只需要简单温和的物理方法激发(光照)和检测，在研究分子生物学特别是核酸时进行指示追踪。这里的荧光染料主要指能特异性结合核酸并改变发光特性的化合物，在仅需要定性判定时，荧光染料显示出简便、低成本的优势。荧光染料在分子生物学中最常见的应用是定量PCR以及凝胶电泳染色。EB(溴化乙锭)本身在紫外灯下不发光，但与单链、双链甚至三链DNA结合后则发出明亮的橙色荧光，而且价格低廉，灵敏度高，但是有高致畸性，威胁实验操作人员的安全。SYBRGreenI是可替代EB的荧光染料，其安全系数高，灵敏度高，在定量PCR荧光染料法中广泛应用，但有实验发现SYBRGreenI在高温以及光源激发时存在稳定性较差的现象，在扩增的过程中也会对反应产生较大的抑制，而且作为进口商品化试剂，其成本较高。所以，有必要开发经济环保、稳定性好、实用性强的荧光染料应用于核酸检测和便携试剂盒中。Barton课题组在20世纪90年代初发现了钌(Ⅱ)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+对双链DNA的分子光开关效应，即钌(Ⅱ)配合物本身不发光，结合双螺旋DNA后显示强发光现象。钌(Ⅱ)配合物具有毒性小、对环境友好且灵敏度高、荧光背景低、水溶性强、斯托克斯(stoke’s)位移大等特点，而且金属钌配合物可以用可见光激发，并发射红光，相对紫外光源激发对操作者视力损伤小。金属钌配合物作为DNA结合染料可以用在开发核酸荧光检测及核酸诊断试剂中，例如，中国专利“基于金属钌配合物的LAMP荧光目视比色检测方法及试剂盒”(公开号：CN109022545A)。但是较高的染料浓度限制了其在PCR荧光目视比色检测中的应用。PCR反应快速、准确，但是需要通过电泳验证反应产物，容易造成扩增子污染。将荧光染料和PCR反应体系混合，可以达到闭管检测的目的，避免了电泳验证，减少了污染，提高了准确性。例如，中国专利“一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒”公开了基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法(公开号：CN108753933A)，但是其应用受限于昂贵的实时荧光PCR仪器。在对核酸扩增结果的检测中，一方面，荧光目视比色的操作简单，不需要昂贵的仪器设备，而且快速、直观。但是为获得明显的比色效果，通常需要较高的染料浓度。而另一方面，为了避免染料抑制反应，需要降低反应体系中染料的浓度，导致显色效果较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法及试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法，包括以下步骤：1)根据扩增靶序列设计PCR引物并合成引物序列；2)从待测样品中提取DNA，以提取的DNA为PCR反应模板，以金属钌配合物为荧光染料，结合步骤1)的引物序列，构建单重荧光PCR反应体系；所述PCR反应体系中，PCR反应模板的浓度为≤10ng/μL，荧光染料的浓度为≥3μM；3)经过步骤2)后，使所述PCR反应体系按照设定程序在闭管条件下进行PCR反应，得到PCR反应产物(结合有荧光染料的靶序列扩增子)，对PCR反应产物在闭管条件下利用可见光(例如，蓝光)进行照射(激发荧光染料)，然后依据PCR反应产物显色情况对扩增结果进行判定，若扩增结果为阳性(即从模板中扩增到靶序列)，则显色，若扩增结果为阴性(即从模板中没有扩增到靶序列)，则仍为无色(不显色)。优选的，所述步骤1)还包括以下步骤：验证引物序列的扩增有效性及特异性。优选的，所述待测样品选自乳制品、生乳或其他生物样品。优选的，所述步骤2)中，根据待测样品的类型选择合适的DNA提取方法。优选的，所述步骤2)还包括以下步骤：以Ct值、荧光增量以及平台期为考察依据，确定PCR反应体系中荧光染料的最佳浓度。优选的，所述PCR反应中，单个扩增循环采用的退火温度为53℃-56℃。优选的，所述金属钌配合物选自[Ru(phen)2(dppz)]2+、[Ru(bpy)2(dppz)]2+、[Ru(phen)2(dppx)]2+等钌多吡啶配合物中的一种；为了增强荧光目视比色分析性能，或选自通过对钌多吡啶配合物的phen、bpy、dppz等配体进行进一步结构修饰而获得的其他金属钌配合物。一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测试剂盒，包括PCR反应试剂(含有Taq酶、dNTPs及缓冲液)、上述金属钌配合物以及用于实现单重荧光PCR反应体系的闭管反应、PCR反应产物的可见光激发和显色情况观察的反应管；所述PCR反应体系中，PCR反应模板的浓度为≤10ng/μL，金属钌配合物的浓度为≥3μM。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术通过控制靶序列扩增中的模板及荧光染料浓度，建立了一种单重荧光PCR扩增与目视比色的检测体系，扩增完成后，在无须开管的情况下直接观察由可见光激发产生的颜色，即可对扩增结果进行判断，可以在靶序列得到扩增的同时，实现在无污染前提下对目标DNA(靶序列)的扩增结果的快速、便捷、直观的定性检测，降低检测成本。进一步的，本专利技术优化了PCR反应条件，降低了PCR扩增循环中的退火温度，从而在低拷贝数模板反应体系中，确保引物扩增的效率和特异性，提高目的产物得率。进一步的，钌多吡啶配合物作为荧光染料，与EvaGreen及SYBRGreenI相比，可以产生更加明显的颜色对比。附图说明图1为金属钌配合物荧光激发、发射光谱及斯托克斯(Stoke’s)位移(A)及SYBRGreenI荧光激发、发射光谱及斯托克斯(Stoke’s)位移(B)示意图。图2为以不同浓度梯度[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为染料的目视比色图。图3为金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+(A)、PCR常用染料EvaGreen(B)及SYBRGreenI(C)的目视比色对比图。图4为灵敏度实验目视比色图：编号G-0、G-1、G-2、G-3、G-4、G-5代表含不同浓度山羊基因组DNA的反应体系。图5为不同实际样品的目视比色图：编号1、2、3、4、5、6代表采用不同乳制品样品提取的模板DNA，编号G代表以山羊基因组DNA为模板的阳性对照。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本专利技术，而不是对本专利技术保护范围的限制。本专利技术针对商品化的PCR染料SYBRGreenI以及EvaGreen存在斯托克斯位移小、目视比色对比不明显等影响实际应用的问题(参见图1)，通过考察金属钌配合物性质，优化选择具有分子光开关行为的配体及荧光检测的条件，最终建立了一种基于聚合酶链式反应(PCR)并借助核酸分子光开关钌(II)配合物直接进行目视比色的核酸扩增检测方法。(一)[Ru(bpy)2(dppz)]2+用于可视化PCR扩增检测的可行性1、以磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒，从市售新鲜山羊乳(预先分离脂肪成分)中提取山羊基因组DNA作为模板，根据山羊的细胞色素b基因保守序列设计物种特异性引物，由生工生物(上海)有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据扩增靶序列设计PCR引物并合成引物序列；2)从待测样品中提取DNA，以提取的DNA为PCR反应模板，以金属钌配合物为荧光染料，结合步骤1)的引物序列，构建单重荧光PCR反应体系；所述PCR反应体系中，PCR反应模板的浓度为≤10ng/μL，荧光染料的浓度为≥3μM；3)经过步骤2)后，使所述PCR反应体系进行PCR反应，得到PCR反应产物，对PCR反应产物进行可见光激发，然后依据PCR反应产物显色情况对扩增结果进行判定，若显色，则扩增结果为阳性，若不显色，则扩增结果为阴性。

【技术特征摘要】
1.一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据扩增靶序列设计PCR引物并合成引物序列；2)从待测样品中提取DNA，以提取的DNA为PCR反应模板，以金属钌配合物为荧光染料，结合步骤1)的引物序列，构建单重荧光PCR反应体系；所述PCR反应体系中，PCR反应模板的浓度为≤10ng/μL，荧光染料的浓度为≥3μM；3)经过步骤2)后，使所述PCR反应体系进行PCR反应，得到PCR反应产物，对PCR反应产物进行可见光激发，然后依据PCR反应产物显色情况对扩增结果进行判定，若显色，则扩增结果为阳性，若不显色，则扩增结果为阴性。2.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法，其特征在于：所述步骤1)还包括以下步骤：验证引物序列的扩增有效性及特异性。3.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法，其特征在于：所述待测样品选自乳制品、生乳或其他生物样品。4.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，DNA的提取方法根据待测样品的类型选择。5.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的PCR荧光目视比色检测方法，其特征在于：所述步骤2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秦峰，李昕，澹台玮，郑蓉，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61