一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法技术

本发明专利技术公开了一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法，属于生物技术领域。所述方法包括攻毒菌株的增菌传代培养，试验动物的攻毒和观察以及细菌的分离与鉴定三部分。其中细菌增菌培养基选择液体硫乙醇酸盐培养基(FT)，传代培养基选择强化布氏血琼脂培养基，可有效增加细菌攻毒菌数量并且缩短细菌培养时间。攻毒方式为攻毒菌液腹腔注射法，攻毒8h后即观察到动物的发病和死亡现象。解剖发病及死亡动物病变组织，接种于选择性培养基胰胨‑亚硫酸盐‑环丝氨酸琼脂基础(TSC)进行分离培养，挑取菌落形态明确的单菌落，接种于FT中进行增菌培养，使用多重PCR方法鉴定分离细菌。所述方法简单且成本低，试验方法可行，试验结果准确可靠。

A Pathogenicity Test Method for Clostridium perfringens from Swine

【技术实现步骤摘要】
一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法
本专利技术涉及一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法，属于生物

技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)作为猪消化道疾病的致病菌，在自然界分布广泛。其具有在恶劣环境条件下仍能产生芽孢的能力，广泛存在于大多数动物的消化道内，这也成为它最潜在的威胁之一。主要临床表现包括仔猪腹泻和出血坏死性肠炎等。文献中报道猪的产气荚膜梭菌病主要由猪产气荚膜梭菌C型和A型毒素型引起，而猪C型产气荚膜梭菌病主要发生在0～7日龄仔猪，其它年龄段甚少。A型产气荚膜梭菌病在不同年龄段均有发生，但是以刚断奶仔猪和出生仔猪发病率较高。该病死亡率极高，使畜牧业造成严重的经济损失。此外，产气荚膜梭菌有通过食物链传染给人的危险。由于抗生素的不合理使用，导致细菌耐药性问题日益严重。临床治疗产气荚膜梭菌病也因为耐药性的产生而变得十分棘手。不同动物源的产气荚膜梭菌对四环素和二甲胺四环素的耐药性分别为33％～73％和17％～40％。研究人员通过对258株猪产气荚膜梭菌进行药敏实验，发现其中200株对四环素耐药，58株对四环素、克林霉素和林可霉素多重耐药。因此，有必要研究和了解产气荚膜梭菌的致病性，以期为临床防治产气荚膜梭菌病提供有效措施。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法，以解决上述现有技术存在的问题，研究和了解产气荚膜梭菌的致病性，以期为临床防治产气荚膜梭菌病提供有效措施。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种猪源产气荚膜梭菌的致病性试验方法，包括以下步骤：(1)攻毒菌株的增菌及传代培养：将猪源产气荚膜梭菌置于FT肉汤中复苏，平板划线于强化布氏血琼脂培养基上传代培养，挑单菌落于液体硫乙醇酸盐培养基(FT培养基)中增菌培养，得增菌培养液；(2)攻毒与观察：取步骤(1)中的增菌培养液腹腔注射试验动物，观察动物的发病及死亡情况；(3)攻毒菌株的分离与鉴定：对发病和死亡动物病变部位进行解剖，涂布于选择培养基中分离，并对分离株进行鉴定，当鉴定结果与攻毒菌株相同时，可判定攻毒菌株为致病性产气荚膜梭菌。优选地，步骤(1)中所述FT培养基的组成为：胰酶消化酪蛋白胨15.0g，胱氨酸0.5g，无水葡萄糖5.0g，酵母膏5.0g，氯化钠2.5g，硫乙醇酸钠0.5g，0.1％刃天青1.0ml，琼脂0.75g，pH值7.1±0.2，蒸馏水1000mL。优选地，步骤(1)中所述强化布氏血琼脂培养基组成为：蛋白胨10.0g，酵母粉2.0g，胰酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖1.0g，亚硫酸氢钠0.1g，琼脂15.0g，pH值7.0±0.2，氯化血红素储藏液1ml，维生素K1工作液1ml，蒸馏水1000mL。优选地，步骤(1)中培养条件为厌氧培养，培养温度为36±1℃，培养时间为8-12h。细菌在FT培养基中培养后可看到菌液表层有大量气泡，布氏琼脂中平板划线培养后可见菌落中有透亮溶血环形成。优选地，所述厌氧条件为80％N2、10％CO2以及10％H2。优选地，步骤(2)中试验动物为雄性昆明小白鼠，7-12周龄，体重20-30g，每只腹腔注入增菌培养液0.2mL。注射后6-72h观察小鼠的发病和死亡情况。优选地，步骤(3)中所述发病和死亡动物病变部位包括小鼠心尖血，病变肠组织等部位。优选地，步骤(3)中所述攻毒菌株的分离与鉴定，包括以下步骤：(a)细菌分离培养：将采集的样品置于FT肉汤中厌氧条件培养8～12h；将菌液混匀，接种添加D-环丝氨酸溶液的TSC培养基，36±1℃厌氧培养20～24h；产气荚膜梭菌在TSC选择鉴别培养基上，生长黑色圆形菌落，菌落周围形成浅黄色浊环，挑取特征单菌落于FT肉汤中备用；(b)鉴定方式为多重PCR鉴定。优选地，步骤(a)所述添加D-环丝氨酸溶液的TSC培养基，其组成为：胰胨15g，大豆胨5g，酵母膏粉5g，偏亚硫酸氢钠1g，柠檬酸铁铵1g，琼脂15g，0.5％D-环丝氨酸溶液20ml，pH7.6±0.2，蒸馏水1000ml。优选地，步骤(b)中所述多重PCR鉴定方法为：PCR引物的合成，PCR模板的制备，PCR体系及反应，电泳以及紫外凝胶成像分析。所述PCR引物的合成由金斯瑞生物科技有限公司合成，所述四种毒力基因引物为：cpa(402bp)上游GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG下游CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATCcpb(236bp)上游ACTATACAGACAGATCATTCAACC下游TTAGGAGCAGTTAGAACTACAGACetx(541bp)上游ACTGCAACTACTACTCATACTGTG下游CTGGTGCCTTAATAGAAAGACTCCιA(317bp)上游GCGATGAAAAGCCTACACCACTAC下游GGTATATCCTCCACGCATATAGTC引物在使用时用无菌超纯水稀释成10μmol/L。所述PCR模板的制备过程为：挑取TSC培养基上特征性单菌落，接种于FT肉汤中，厌氧培养8-12h，此菌液可直接作为模板进行鉴定。或用接种环从TSC培养基上挑选纯培养物，置于0.5mL灭菌水中，12000r/min离心2min，弃上清，再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为PCR模板。所述PCR反应体系为：12.5μL2×TaqMasterMix，引物各0.125μL，模板2μL，无菌超纯水补至25μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，增30个循环；72℃终延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。电泳过程为：取5μLPCR扩增产物和5μLMarker加入加样孔，每次电泳时，各做阳性对照对照孔和阴性对照对照孔。电泳条件：电压110V，电泳时间30min。结果判定：电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。反应结果应同时符合以下7个条件，否则实验无效：a)阴性对照未出现特异性条带；b)A型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素；c)B型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素、236bp的β毒素和541bp的ε毒素。d)C型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和236bp的β毒素；e)D型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和541bp的ε毒素；f)E型产气荚膜梭菌阳性对照出现402bp的α毒素和317bp的ι毒素；如果某一待检样品扩增产物的条带与产气荚膜梭菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为产气荚膜梭菌，必要时可通过测序来进一步确证。优选地，步骤(3)中攻毒判定指标包括培养特性，菌落形态以及PCR鉴定结果。本专利技术中猪源产气荚膜梭菌致病性试验方法包括攻毒菌株的增菌传代培养，试验动物的攻毒与观察，细菌的分离与鉴定三个步骤。其中细菌增菌培养基选择液体硫乙醇酸盐培养基(FT)，传代培养基选择强化布氏血琼脂培养基，可有效增加细菌攻毒菌液数量并且缩短细菌培养时间。攻毒方式为攻毒菌液腹腔注射法，攻毒8h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪源产气荚膜梭菌的致病性试验方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)攻毒菌株的增菌及传代培养：将猪源产气荚膜梭菌置于FT肉汤中复苏，平板划线于强化布氏血琼脂培养基上传代培养，挑单菌落于FT培养基中增菌培养，得增菌培养液；(2)攻毒与观察：取所述增菌培养液腹腔注射试验动物，观察动物的发病及死亡情况；(3)攻毒菌株的分离与鉴定：对发病和死亡动物病变部位进行解剖，涂布于选择培养基中分离，并对分离株进行鉴定，当鉴定结果与攻毒菌株相同时，可判定攻毒菌株为致病性产气荚膜梭菌。

【技术特征摘要】
1.一种猪源产气荚膜梭菌的致病性试验方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)攻毒菌株的增菌及传代培养：将猪源产气荚膜梭菌置于FT肉汤中复苏，平板划线于强化布氏血琼脂培养基上传代培养，挑单菌落于FT培养基中增菌培养，得增菌培养液；(2)攻毒与观察：取所述增菌培养液腹腔注射试验动物，观察动物的发病及死亡情况；(3)攻毒菌株的分离与鉴定：对发病和死亡动物病变部位进行解剖，涂布于选择培养基中分离，并对分离株进行鉴定，当鉴定结果与攻毒菌株相同时，可判定攻毒菌株为致病性产气荚膜梭菌。2.根据权利要求1所述的一种猪源产气荚膜梭菌的致病性试验方法，其特征在于：步骤(1)中所述FT培养基的组成为：胰酶消化酪蛋白胨15.0g，胱氨酸0.5g，无水葡萄糖5.0g，酵母膏5.0g，氯化钠2.5g，硫乙醇酸钠0.5g，0.1％刃天青1.0ml，琼脂0.75g，pH值7.1±0.2，蒸馏水1000mL。3.根据权利要求1所述的一种猪源产气荚膜梭菌的致病性试验方法，其特征在于：步骤(1)中所述强化布氏血琼脂培养基组成为：蛋白胨10.0g，酵母粉2.0g，胰酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖1.0g，亚硫酸氢钠0.1g，琼脂15.0g，pH值7.0±0.2，氯化血红素储藏液1ml，维生素K1工作液1ml，蒸馏水1000mL。4.根据权利要求1所述的一种猪源产气荚膜梭菌的致病性试验方法，其特征在于：步骤(1)中培养条件为厌氧培养，培养温度为36±1℃，培养时间为8-12h。5.根据权利要求4所述的一种猪源产气荚膜梭菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝海红，袁宗辉，罗讯，徐紫慧，黄玲利，王玉莲，彭大鹏，王旭，陈冬梅，陶燕飞，潘源虎，谢书宇，程古月，瞿玮，刘振利，谢长清，房诗薇，黄啸，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42