一种检测病原体的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测病原体的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种荧光标记的引物，所述荧光标记的引物对病原体靶标核酸进行扩增，然后利用病原体靶标核酸的扩增产物的熔解曲线实现病原体检测。本发明专利技术用基于产物的熔解曲线检测多靶标核酸，可以实现多靶标的同时检测，大大提高检测通量和效率，降低检测成本。

A kit for detecting pathogens

【技术实现步骤摘要】
一种检测病原体的试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种同时检测多个靶标核酸的方法及其试剂盒。
技术介绍
目前临床上常见的病原微生物感染症状有呼吸道感染，胃肠道感染，泌尿生殖道感染等，而引起这些症状的病原微生物较为复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，给疾病诊断和治疗造成极大的困难。若感染所致疾病得不到快速诊断，则只能经由临床医生的经验和现有知识给予治疗，而这些治疗方法常伴随着广谱抗生素的滥用，引起多重耐药菌的出现和医院获得性感染的发生。多种病原体同时检测的策略，以及病原体的快速、准确鉴定在疾病管理中至关重要。传统的病原微生物检测方法技术复杂、阳性率低，而且耗时耗力，部分病原体培养条件苛刻甚至不能培养或需要专业的技术人员操作等制约条件使得其难以应用于临床早期诊断和指导治疗；免疫荧光技术、血清学试验等敏感度和特异性也很少能满足临床诊断的需要。随着生物学新技术的发展，分子诊断技术逐渐成为临床微生物实验室不可或缺的检验技术。由于临床样品中未知病原体感染以及多病原体混合感染，常规单病原体核酸检测方法往往需要进行多次筛选，相对费时费力。多重靶标检测能够实现多个病原体的快速鉴别和诊断，降低检验成本。多重靶标检测具有高效性、系统性和经济简便性等优点，已广泛应用于病原微生物的检测。常见的多重靶标检测技术有以下几种。实时荧光PCR技术通过在PCR反应体系中加入不同的荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高特异性、有效解决PCR污染问题、快速等优点，是目前核酸检测广泛运用的方法。但由于受目前市场上荧光PCR仪通道的限制，单管最多只能检测4-5个靶标，不能满足临床上某一症候群相关的多种病原体或基因同时筛查的需求。基因芯片技术又称为DNA微阵列，是通过微加工技术，将大量DNA探针固定到硅片、玻片等固态支持物上，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，获得样品的基因序列信息。此项技术可对多达上万个基因进行同时检测和分析，具有微型化、高通量等特点。但基因芯片技术仍存在一些问题，如检测灵敏度低，特异性较差，芯片制作成本高，且需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。高通量测序技术是近年来发展迅猛的生物技术，通过对DNA(或cDNA)随机片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中数以万计的克隆进行延伸反应，检测对应的信号，最终获取序列信息。该技术通量大，灵敏度高，尤其在一些新发疾病病原体的检测、未知病原体鉴别和突发疾病的防控中发挥重要作用。但目前该技术仍然存在一些待解决的问题：测序产生的海量数据需要专业的人员进行分析；测序的时间和成本仍然制约着其在临床上的广泛应用。等温扩增是一种能够在恒定温度下，实现核酸的快速检测，其检测时效快，以及只需要在恒定温度下就可以实现越来越受到关注。目前核酸等温扩增检测有很多种方式，比如LAMP，HDA，RPA，NASBA等恒温扩增方式。不同的等温扩增系统根据应用场景有所不同，等温扩增系统，通常使用一些化学试剂，如LAMP检查用的中性红染料，电泳用到的核酸染料，在其他一些核酸等温使用分子信标系统以及Taqman自淬灭探针，这些信号检测系统由于受到仪器通道数量的限制，无法实现多重检测。鉴于目前临床上对简便快速，灵敏度高，特异性好及多靶标检测技术的需求，而现有技术都有其局限性，不能完全满足临床的需求，因此我们亟需开发出一种快速，准确且低成本的检测技术。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种检测病原体的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种荧光标记的引物，所述荧光标记的引物对病原体靶标核酸进行扩增，然后利用病原体靶标核酸的扩增产物的熔解曲线实现病原体检测。在一种实施方式中，所述扩增包括荧光PCR扩增、解旋酶依赖扩增或重组酶依赖扩增。在一种实施方式中，荧光标记在所述引物的5’端到3’端之间的序列，优选地标记在所述引物5’到3’的中间位置。在一种实施方式中，所述试剂盒是用于多种病原体检测的试剂盒，所述试剂盒包括多种荧光标记的引物，使得同一荧光通道内不同的病原体核酸的扩增产物的熔解曲线具有不同的熔点Tm值，并且同一荧光通道内的相邻不同靶标核酸的扩增产物的Tm值相差2-20℃，优选为相差2-8℃，从而实现基于荧光引物的扩增产物熔解曲线同时检测多个靶标核酸。在一种实施方式中，所述试剂盒是用于同时沙眼衣原体和解脲脲原体的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：，其中CT表示沙眼衣原体和UU表示解脲脲原体。在一种实施方式中，所述试剂盒是用于同时检测常见性病病原体沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟淋球菌和HSV-2单纯疱疹病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计特异性上、下游引物，所述上、下游引物分别如下：，其中CT表示病原体沙眼衣原体、UU表示解脲脲原体、NG表示奈瑟淋球菌和HSV2表示HSV-2单纯疱疹病毒，IC表示内参。在一种实施方式中，所述试剂盒是通过解旋酶依赖扩增检测病原体解脲脲原体的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：。在一种实施方式中，所述试剂盒是通过利用重组酶依赖扩增检测病原体奈瑟淋球菌的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：。在一种实施方式中，所述试剂盒包括逆转录试剂。在一种实施方式中，所述试剂盒是检测甲型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：本专利技术的主要优点如下：1.利用基于产物的熔解曲线检测多靶标核酸，可以实现多靶标的同时检测，大大提高检测通量和效率，降低检测成本；2.直接在引物上标记荧光，减少探针的使用，避免引物探针之间非特异结合而降低扩增效率，提高检测灵敏度；3.利用荧光基团的自身淬灭，避免淬灭基团的使用，检测荧光信号增强，提高检测灵敏度；4.检测体系中引物合成成本大大降低，可降低患者费用，于患者有益。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是本专利技术试剂盒反应的原理图；图2是表示CT不同方式标记荧光报告基团的FAM通道熔解曲线图；图3是表示以FAM通道检测CT(A表示)和UU(B表示)的产物熔解曲线图；图4是表示以FAM通道检测CT(A表示)、UU(B表示)、IC内标(C表示)的产物熔解曲线图；图5是表示以HEX通道检测NG(A表示)和HSV2(B表示)的产物熔解曲线图；图6是表示性病UU的HDA等温检测的扩增曲线图；图7是表示性病UU的HDA等温检测的熔解曲线图；图8是表示性病NG的RPA等温检测的扩增曲线图；图9是表示性病NG的RPA等温检测的熔解曲线图；图10是表示甲流H1N1检测扩增曲线图；图11是表示甲流H1N1检测熔解曲线图。具体实施方式为了使本
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一种或多种荧光标记的引物，所述荧光标记的引物对病原体靶标核酸进行扩增，然后利用病原体靶标核酸的扩增产物的熔解曲线实现病原体检测。

【技术特征摘要】
1.一种检测病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一种或多种荧光标记的引物，所述荧光标记的引物对病原体靶标核酸进行扩增，然后利用病原体靶标核酸的扩增产物的熔解曲线实现病原体检测。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增包括荧光PCR扩增、解旋酶依赖扩增或重组酶依赖扩增。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，荧光标记在所述引物的5’端到3’端之间的序列，优选地标记在所述引物5’到3’的中间位置。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于多种病原体检测的试剂盒，所述试剂盒包括多种荧光标记的引物，使得同一荧光通道内不同的病原体核酸的扩增产物的熔解曲线具有不同的熔点Tm值，并且同一荧光通道内的相邻不同靶标核酸的扩增产物的Tm值相差2-20℃，优选为相差2-8℃，从而实现基于荧光引物的扩增产物熔解曲线同时检测多个靶标核酸。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于同时沙眼衣原体和解脲脲原体的试剂盒，所述试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘利成，冯华华，胡小许，潘珊珊，王培培，赵相胜，
申请(专利权)人：江苏宏微特斯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32