用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒，所述试剂盒包括针对每个待测病原体设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50

【技术实现步骤摘要】
用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒。

技术介绍

[0002]传统实时荧光PCR技术通过在PCR反应体系中加入不同的荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高特异性、有效解决PCR污染问题、快速等优点，是目前核酸检测广泛运用的方法。但由于受目前市场上荧光PCR仪通道的限制，单管最多只能检测4
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5个靶标，不能满足临床上某一症候群相关的多种病原体或基因同时筛查的需求。
[0003]目前临床上常见的病原微生物感染症状有呼吸道感染，血流感染，泌尿生殖道感染、等，而引起这些症状的病原微生物较为复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，需要同时进行多重病原微生物进行检测，给疾病诊断和治疗造成极大的困难。若感染所致疾病得不到快速诊断，则只能经由临床医生的经验和现有知识给予治疗，而这些治疗方法常伴随着广谱抗生素的滥用，引起多重耐药菌的出现和医院获得性感染的发生。多种病原体同时检测的策略，以及病原体的快速、准确鉴定在疾病管理中至关重要。
[0004]传统的培养法是目前诊断的金标准，但该方法检测速度慢，操作繁琐，无法定量检测，且假阴性率高。对于血流感染发展至脓毒性休克的患者，若缺乏及时的治疗其生存时间以小时为单位急剧下降。因此，我们迫切需要一种快速准确鉴定病原体的方法。近年来，随着分子检测手段的发展，用于快速诊断BSI病原菌的方法层出不穷，这些分子诊断技术被用于补充培养的不足，可分为基于阳性血培养样本病原菌检测和全血中直接检测病原菌的检测方法。前者包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析、荧光原位杂交技术、多重PCR技术、DNA微阵列技术等；后者包括实时定量PCR、二代测序技术、数字PCR技术等。二代测序技术可快速对样本中全部DNA或RNA进行测序，能一次性对多个靶基因进行检测，具有敏感性及特异性高、所需样本量小等优势。但存在检测费用高、周期相对长、不能检测耐药基因、需要专业团队等，尤其是检测报告时间常需要 2～3d，但其对临床少见菌的鉴定和新菌种的发现方面更具优势。
[0005]鉴于目前临床上对简便快速，灵敏度高，特异性好及多靶标检测技术的需求，而现有技术都有其局限性，不能完全满足临床的需求，因此我们亟需开发出一种快速，准确且低成本的多重检测技术。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供一种用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0007]a.针对每个待测病原体设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50
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70℃，所述探针的Tm值范围为 60
～80℃，实现对每个待测病原体的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测病原体的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针含至少1个 RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5
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端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3
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端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述下游引物及探针分别与各自待测病原体特异性结合，形成探针
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模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA
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RNA杂交链；
[0008]b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RAN碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；
[0009]c.核酸聚合酶和dNTP，在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物情况下，所述聚合酶使得待测病原体生成带荧光标记的PCR产物。
[0010]在一种实施方式中，所述试剂盒是单管检测热带念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌的试剂盒，它们的引物和探针如下：
[0011][0012][0013]在一种实施方式中，热带念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、和/或肺炎克雷伯菌引物的终浓度为0.1～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM，优选地，热带念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，光滑念珠菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/ 或，阴沟肠杆菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，白色念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.2mM；和/或，粘质沙雷菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，奇异变形杆菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为 0.05mM；和/或，粪肠球菌引物的终浓度为0.1mM和探针终浓度为0.05mM时；和/或，肺炎克雷伯菌引物(KPN
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R1)的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.05mM时。
[0014]在一种实施方式中，所述试剂盒是单管检测的试剂盒，其检测的是鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、克柔念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎链球菌、近平滑念珠菌和无乳链球菌，它们的引物和探针如下：
[0015][0016][0017]在一种实施方式中，鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、克柔念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎链球菌、近平滑念珠菌和/或无乳链球菌引物的终浓度为0.1～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM。
[0018]在一种实施方式中，鲍曼不动杆菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，大肠埃希菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，表皮葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，屎肠引物的终浓度为0.1mM 和探针的终浓度为0.1mM；和/或，金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.2mM；和/或，铜绿假单胞菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，克柔念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，产酸克雷伯菌引物的终浓度为0.2mM和探针终浓度为0.1mM；和/或，肺炎链球菌引物的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.1mM，和/或，近平滑念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.1mM，和/或，无乳链球菌引物的终浓度为0.2mM和探的终浓度为0.2mM。
[0019]在一种实施方式中，所述dNTP浓度设为0.2mM。
[0020]在一种实施方式中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：a.针对每个待测病原体设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50
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70℃，所述探针的Tm值范围为60～80℃，实现对每个待测病原体的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测病原体的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5
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端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3
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端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述下游引物及探针分别与各自待测病原体特异性结合，形成探针
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模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA
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RNA杂交链；b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RAN碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；c.核酸聚合酶和dNTP，在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物情况下，所述聚合酶使得待测病原体生成带荧光标记的PCR产物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒是单管检测热带念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌的试剂盒，它们的引物和探针如下：
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，热带念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、和/或肺炎克雷伯菌引物的终浓度为0.1～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM，优选地，热带念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，光滑念珠菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，阴沟肠杆菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，白色念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.2mM；和/或，粘质沙雷菌引物的终浓度为0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶海霞，杨红雷，赵佩佩，翟传新，傅重阳，胡小许，冯华华，刘利成，
申请(专利权)人：江苏宏微特斯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：