【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，特别涉及pcr仪单通道单管检测至少四个待测目标核酸序列的方法及其应用。
技术介绍
1、本专利技术是在申请人在先申请号201811411923.0和202210550770.8基础上进一步研发得到的，在先申请中提供一种单管检测多个待测目标核酸序列的方法，所述方法利用pcr扩增产物的熔点tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列，所述方法针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点tm值通过pcr仪能够区分。
2、在申请号201811411923.0和202210550770.8专利申请中，用pcr扩增产物的熔点tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列时，pcr扩增产物的熔点tm值的范围较窄，限制检测通量，尤其对引起某一症候群相关的病原体较多时，无法满足检测需求，如呼吸道相关的病原体，包括病毒和病原菌；血流感染等。因此为增大单管检测通量，在201811411923.0专利基础上，进行进一步的开发，提高系统的检测通量。
3、现行市面上基于pcr探针法的熔解曲线技术也面临着熔点tm值的范围较窄，当病原体较多时，需增加检测管数，或使用更多荧光通道的荧光定量pcr仪，成本增加或使用受限。
4、因此，本专利技术基于上述问题进行了优化改进，使其单管可检测的通量增加，更好的满足多病原体检测需求。
技术实现思路
1、为了解决上
2、在一种实施方式中，通过pcr探针熔解曲线法进行检测时，针对每个待测目标核酸序列设计特异性上游、下游引物和探针，所述探针上包括荧光报告基团和淬灭基团修饰，并对探针进行修饰以调节探针的tm，所述修饰方式包括间臂类修饰、mgb修饰和/或lna修饰，其中通过间臂类修饰来降低待测目标核酸序列的tm值，而通过mgb或lna的修饰来提高待测目标核酸序列的tm值。
3、在一种实施方式中，所述间臂类修饰是isp18修饰、ispc12修饰、isp9修饰或ispc6修饰。
4、在一种实施方式中，所述间臂类修饰位置是在所述探针序列5’端至探针序列中间位置。
5、在一种实施方式中，所述间臂类修饰基团的数量为1-4个。
6、在一种实施方式中，pcr扩增产物的熔解曲线法进行检测中探针含至少1个rna碱基，在所述rna碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述rna碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述rna碱基的左侧所述探针片段熔点tm值高于在所述rna碱基的右侧所述探针片段熔点tm值。
7、在一种实施方式中，提供一种试剂盒，其在上述方法中应用。
8、在一种实施方式中，所述试剂盒是用于检测hpv16，18，31，33，35型的试剂盒，其中hpv16、hpv18通过pcr探针熔解曲线法进行检测，hpv31、hpv33和hpv35通过pcr扩增产物的熔解曲线法进行检测，它们相应的引物和探针如下：
9、
10、
11、在本专利技术中，针对每个待测目标核酸序列设计特异性上游、下游引物和探针，所述特异性探针包括两种形式，一种为序列上进行荧光报告基团和淬灭基团修饰，并对探针进行特殊修饰以调节探针的tm，命名为cprobe。特殊修饰包括但不限于间臂类修饰、mgb、lna等。另一种为探针含至少1个rna碱基，在所述rna碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述rna碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述rna碱基的左侧所述探针片段熔点tm值高于在所述rna碱基的右侧所述探针片段熔点tm值；所述至少1个rna碱基优选地为至少1个连续的rna碱基，更优选地为1个rna碱基，命名为rprobe。
12、本专利技术的主要优点如下：
13、1.利用基于产物的熔解曲线和基于cprobe荧光探针的熔解曲线进行结合，检测tm范围更广，单管单通道可实现更多重的靶标检测。
14、2.可解决临床症候群相关病原体较多时的通量问题，节省时间和成本以及样本量；
15、3.基于特异性的产物以及特异性的荧光探针进行熔解曲线分析，具有优异的特异性。
16、4.整个过程闭管操作，避免扩增污染。
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1.PCR仪单通道单管检测至少四个待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法在检测至少四个待测目标核酸序列时，将所述至少四个待测目标核酸序列分成二组，每组检测至少二个待测目标核酸序列，一组通过PCR探针熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列Tm值范围在50-70℃，且各个待测目标核酸序列PCR探针熔解曲线法中Tm值彼此相差至少3℃；另一组通过PCR扩增产物的熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列Tm值范围在70-90℃，且各个待测目标核酸序列PCR扩增产物的熔解曲线法中Tm值彼此相差至少3℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR探针熔解曲线法进行检测时，针对每个待测目标核酸序列设计特异性上游、下游引物和探针，所述探针上包括荧光报告基团和淬灭基团修饰，并对探针进行修饰以调节探针的Tm，所述修饰方式包括间臂类修饰、MGB修饰和/或LNA修饰，其中通过间臂类修饰来降低待测目标核酸序列的Tm值，而通过MGB或LNA的修饰来提高待测目标核酸序列的Tm值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述间臂类修饰是iSp18修饰
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述间臂类修饰位置是在所述探针序列5’端至探针序列中间位置。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述间臂类修饰基团的数量为1-4个。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增产物的熔解曲线法进行检测中探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值。
7.试剂盒，其在权利要求1-6任一所述方法中应用。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于检测HPV16，18，31，33，35型的试剂盒，其中HPV16、HPV18通过PCR探针熔解曲线法进行检测，HPV31、HPV33和HPV35通过PCR扩增产物的熔解曲线法进行检测，它们相应的引物和探针如下：
...【技术特征摘要】
1.pcr仪单通道单管检测至少四个待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法在检测至少四个待测目标核酸序列时，将所述至少四个待测目标核酸序列分成二组，每组检测至少二个待测目标核酸序列，一组通过pcr探针熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列tm值范围在50-70℃，且各个待测目标核酸序列pcr探针熔解曲线法中tm值彼此相差至少3℃；另一组通过pcr扩增产物的熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列tm值范围在70-90℃，且各个待测目标核酸序列pcr扩增产物的熔解曲线法中tm值彼此相差至少3℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过pcr探针熔解曲线法进行检测时，针对每个待测目标核酸序列设计特异性上游、下游引物和探针，所述探针上包括荧光报告基团和淬灭基团修饰，并对探针进行修饰以调节探针的tm，所述修饰方式包括间臂类修饰、mgb修饰和/或lna修饰，其中通过间臂类修饰来降低待测目标核酸序列的tm值，而通过mgb或lna的修饰来提高待测目标核酸序列的tm值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述间臂...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡小许，杨红雷，常沙沙，陶海霞，郭淑婷，南保林，
申请(专利权)人：江苏宏微特斯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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