【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及prpp合成酶突变体及其在高效合成nad及nadp辅酶中的应用。
技术介绍
1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad)及其磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadp)作为细胞内重要的辅酶，直接参与传递电子，连接柠檬酸循环及电子传递链。它们除了在能量传递上的作用，nad和nadp还在细胞的氧化还原反应中起到重要的辅助作用。它们能够传递电子，参与多种氧化还原酶的催化反应，以维持细胞内的氧化还原水平及平衡多种酶的活性。此外，它们还在调节细胞信号转导中发挥作用，作为信号分子，与一些特定的酶结合，调节酶的活性与功能，从而影响细胞的生长、分化和凋亡等关键过程，对生物体寿命延长具有重要意义。
2、nad和nadp在工业应用上也具有重要作用，它们是许多脱氢酶的辅酶，参与电子间的传递。nad的酶法合成路线是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nicotinamidemononucleotide adenylyl transferase，nmnat)以β-烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononuclotide，nmn)及腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，atp)为底物合成nad。再在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(nicotinamide adenine dinucleotide kinase，nadk)的作用下，将atp的磷酸基团转移到n
3、根据来自各种生物体内的prs氨基酸序列比对显示，不同来源的prs之间具有一定的相似性。根据不同来源的prs的氨基酸序列同一性，可以对其进行分类，现报道了三类prs，它们在活性，变构调节机制和二磷酰基供体特异性方面有所不同。i类prs是目前研究最多的，也是应用最广泛的，但是该类酶对腺苷二磷酸(adp)和鸟苷二磷酸(gdp)的反馈抑制敏感，其中adp的变构抑制最为明显。ⅱ类prs缺乏adp的变构结合位点，但该类酶的活性普遍较低。ⅲ类prs主要来源于古生菌，这一类的prs生理生化特性似乎是i类和ii类prs特性的混合物，但目前研究较少，基本没有相关应用的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，并将其应用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中，以克服现有技术中存在的磷酸核糖焦磷酸合成酶活性不高，易受到腺苷二磷酸的抑制，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸合成产量不理想的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本专利技术提供了一种磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第111位、第187位、第309位进行单突变或多点联合突变后获得。
4、本专利技术旨在以prpp作为重要中间体，通过多酶级联催化合成最终产物nad或nadp。本申请选取了i类prs来自于bacillus amyloliquefaciens的磷酸核糖焦磷酸合成酶(baprs)进行了分子改造，以提高其酶活，并降低反应过程中副产物adp的抑制作用，减少酶的用量，用于高效合成重要中间体prpp，从而进一步获得终产物nad或ndap。来源于bacillus amyloliquefaciens的磷酸核糖焦磷酸合成酶的氨基酸序列如seq id no.2所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、本专利技术针对baprs，通过大分子建模技术模拟baprs的三维结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点。选择定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类后，相应的引物由杭州擎科生物有限公司合成，以prs-pet 28a(+)载体质粒为模板，pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增突变dna片段，分离纯化，然后以pcr将所得片段扩增为全长突变基因。通过将该全长突变基因克隆到pet-28a(+)载体上并转入dh5α宿主菌中，经培养筛选出具有突变基因载体的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒dna，进行dna序列测定分析，以确定引入的突变。筛选得到的阳性质粒转入bl21(de3)宿主菌中诱导表达，从中筛选出活性有显著提高的突变体。具体的，本专利技术针对baprs，通过大分子建模技术以及通过定点突变来降低蛋白整体结构的自由能来增加蛋白稳定性，通过蛋白结构自由能计算预测出了多个位点，可能与提高稳定性有关。
6、作为优选，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如seq id no.2所示的氨基酸序列突变为下列之一：(1)第111位谷氨酸突变变为天冬氨酸、组氨酸或甲硫氨酸；(2)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、组氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；(3)第309位赖氨酸突变为精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸；(4)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；(5)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为组氨酸；(6)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为精氨酸；(7)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
7、作为优选，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
8、作为优选，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的氨基酸序列如seq id no.26所示。
9、作为优选，编码所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的核苷酸序列如seq idno.25所示。
10、第二方面，本专利技术提供了一种含有编码以上所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的重组载体。
11、具体地，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第111位、第187位、第309位进行单突变或多点联合突变后获得。
2.如权利要求1所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列突变为下列之一：(1)第111位谷氨酸突变变为天冬氨酸、组氨酸或甲硫氨酸；(2)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、组氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；(3)第309位赖氨酸突变为精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸；(4)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；(5)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为组氨酸；(6)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为精氨酸；(7)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
3.如权利要求1或2所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨
4.如权利要求3所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
5.如权利要求4所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，编码所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
6.一种含有编码如权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的重组载体。
7.一种含有编码如权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的基因工程菌。
8.权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体在合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。
9.权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体在合成磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，以磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体、烟酰胺磷酸核糖基转移酶、多聚磷酸激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶为催化剂，以5-磷酸核糖、腺苷三磷酸和烟酰胺为底物，加入氯化镁和多聚磷酸盐，以pH7.5的缓冲液为反应介质，在37℃下反应，获得磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
...【技术特征摘要】
1.一种磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第111位、第187位、第309位进行单突变或多点联合突变后获得。
2.如权利要求1所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如seq id no.2所示的氨基酸序列突变为下列之一：(1)第111位谷氨酸突变变为天冬氨酸、组氨酸或甲硫氨酸；(2)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、组氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；(3)第309位赖氨酸突变为精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸；(4)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；(5)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为组氨酸；(6)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为精氨酸；(7)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
3.如权利要求1或2所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，洪健，沈其，程峰，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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