一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基及诱导方法技术

技术编号：40181230 阅读：22 留言：0更新日期：2024-01-26 23:47

本方案公开了再生医学技术领域的一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基及诱导方法，包括以下步骤：S1：将第3代人羊膜间充质干细胞铺于24孔板上培养，其生长密度达80％；S2：取胎牛血清、activin A和B27加入到RPMI 1640培养基中，轻柔吹打均匀，得到诱导培养基，所述诱导培养基中胎牛血清、activin A和B27的终浓度分别为0.5％、100ng/ml、1×；S3：步骤S1所述的人羊膜间充质干细胞生长密度达到80％时，将24孔板中的培养基上清吸出，用PBS缓冲液洗涤3次，然后将PBS缓冲液吸尽，沿24孔板加入步骤S2得到的培养基，于5％CO<subgt;2</subgt;的37℃培养箱中培养6天，第3天换液一次。本方案可提高分化效率，使分化更彻底。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及再生医学，特别涉及一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基及诱导方法。

技术介绍

1、人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hamscs)为间充质干细胞的一类分支，属于成体干细胞的一种。通常来说，获得hamscs的方法是通过将产妇分娩后遗弃的胎盘钝性剥离出羊膜组织，然后使用一定浓度的胰蛋白酶和胶原酶来消化羊膜组织，最终通过钢网过滤分离得到。hamscs可表达胚胎干细胞表面标志物(oct-3/4、ssea-3、ssea-4、rex-1)，其中，oct-4被认为是多能干细胞自我更新和多向分化潜能的基因。hamscs因其具有多向分化潜能，故常用定向诱导并检测作为其鉴定方法，一般对hamscs进行成骨、成脂和成软骨诱导。hamscs被认为是介于胚胎干细胞和成体干细胞中间阶段的细胞，增殖能力强但无致瘤性。hamscs相较于骨髓间充质干细胞而言，能分泌更丰富的多种细胞因子和具有更强的增殖能力。在体外适当的条件下，hamscs具有向3个胚层的不同组织细胞类型分化的潜能，例如：神经细胞(外胚层)；成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞和心肌细胞(中胚层)；肝样细胞、胰岛细胞(内胚层)。hamscs不表达主要组织相容性ⅱ类抗原(hla-dp、hla-dq、hla-dr)，微量表达主要组织相容性ⅰ类抗原(hla-a、hla-b、hla-c)，同时也不表达共刺激分子(cd80、cd83、cd86、cd40l等)，故表明hamscs具有低免疫原性。除上述优点外，h

2、定型内胚层(definitive endoderm，de)是胚胎发育过程中的一个重要阶段，de细胞可以进一步分化为肝脏、胰腺、肺脏及肠管等组织的细胞。目前，对于de细胞的鉴定主要通过检测y染色体性别决定区域盒17(sex determining region y-box 17，sox17)及叉头盒a2(forkhead box a2，foxa2)。根据已有的文献报道，诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells，ipscs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells，escs)等可在体外诱导分化形成de细胞，但这两类细胞均存在一定的局限性：ipscs因其具有着无限增殖的潜能，导致其存在着严重的致瘤性，特别是在进行细胞移植的过程中，即使少量的ipscs残留也可能导致畸胎瘤的形成。此外，ipscs还存在着免疫原性、细胞异质性等问题；而escs的获得途径存在着伦理问题，故导致两种细胞无法得以广泛应用。有文献表明，脂肪、骨髓、牙髓和脐带来源的间充质干细胞可以诱导分化为de细胞，但却存在着分化效率不高、分化不彻底等问题。

技术实现思路

1、本专利技术意在提供一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基及诱导方法，以解决分化效率不高、分化不彻底的问题。

2、本方案中的一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基，包括rpmi 1640培养基和添加剂。

3、进一步，所述添加剂由0.5％胎牛血清、100ng/ml activin a和1×b27组成。

4、一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导方法，包括以下步骤：

5、s1：将第3代人羊膜间充质干细胞铺于24孔板上培养，其生长密度达80％；

6、s2：取胎牛血清、activin a和b27加入到rpmi 1640培养基中，轻柔吹打均匀，得到诱导培养基，所述诱导培养基中胎牛血清、activin a和b27的终浓度分别为0.5％、100ng/ml、1×；

7、s3：步骤s1所述的人羊膜间充质干细胞生长密度达到80％时，将24孔板中的培养基上清吸出，用pbs缓冲液洗涤3次，然后将pbs缓冲液吸尽，沿24孔板加入步骤s2得到的培养基，于5％ co2的37℃培养箱中培养6天，第3天换液一次。

8、本方案的工作原理及其有益效果：1、本专利技术的人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导方法采用的人羊膜间充质干细胞具有增殖能力强、易于提取与培养、无伦理限制、无免疫排斥、无致瘤性和具有多向分化潜能等优点；

9、2、本专利技术的人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导方法避免了其他方法如诱导多能干细胞在诱导过程中存在致瘤性的问题，更适合产业化和临床应用；

10、3、本专利技术的人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基及诱导方法使用的成分简单，技术要求较低，从而很大程度上增加了实验的可行性且易产业化。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基，其特征在于：包括RPMI 1640培养基和添加剂。

2.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基，其特征在于：所述添加剂由0.5％胎牛血清、100ng/ml activin A和1×B27组成。

3.根据权利要求2所述的一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导方法，其特征在于：包括以下步骤：

【技术特征摘要】

1.一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基，其特征在于：包括rpmi 1640培养基和添加剂。

2.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞定向分化为定型内胚层的诱导培养基，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欢，刘正芸，易世豪，王天顺，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：

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