检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用，属于生物技术领域，特别是涉及医学诊断领域。本发明专利技术中我们公开了检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。可以通过对胃癌预后预测和胃癌化疗耐药评估进行标记，并利用免疫组化化学技术检测PITX1基因的表达水平，从而获得预测胃癌预后和化疗耐药的情况，且PITX1基因的引入方式简单，整个预测评估简便易行，可行性高。

Application of reagent for detecting PITX1 expression in preparation of prognostic kit for gastric cancer

The invention relates to an application of a reagent for detecting the amount of PITX1 expression in the preparation of a prognostic kit for gastric cancer, which belongs to the technical field of biology, in particular to the field of medical diagnosis. The invention discloses an application of a reagent for detecting the amount of PITX1 expression in the preparation of a prognostic kit for gastric cancer. You can mark through the assessment of the prognosis of gastric cancer and gastric cancer predict resistance to chemotherapy, the expression level and using immunohistochemistry technique to detect the PITX1 gene, resulting in predicting the prognosis of gastric cancer and resistance to chemotherapy, and the PITX1 gene into the simple way, the forecast evaluation is simple, feasible and high.

【技术实现步骤摘要】
检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用
本专利技术涉及检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用，属于生物
，特别是涉及医学诊断领域。
技术介绍
胃癌是严重危害我国人民健康的疾病，到目前为止尚无较好的靶向药物，造成患者治疗效果差，预后不良。另外，胃癌是一个异质性很高的疾病，不同患者的病因不同，造成诊断和治疗上的差别。尤其是不同遗传基础，可能造成患者化疗用药的疗效差别。目前国内外尚没有可以有效对这种化疗用药疗效差别进行预后判断的技术手段。建立有效的术后预后预测标志物、发掘化疗耐药相关分子对于确证哪些患者术后可能出现复发转移并且需及时开展术后放化疗治疗，哪些患者对于化疗会产生抵抗，需要选择个体化治疗（如分子靶向治疗）具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对胃癌提供一种可靠的预后评估试剂盒，从而可以监控胃癌患者的预后情况，使其能够及时就诊；同时利用预后评估结果指定个体化治疗方案，合理应用化疗药物，避免无效的化疗，提高有效治愈率。为了实现这一专利技术目的，我们公开了检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。胃癌细胞PITX1基因的表达水平与5氟尿嘧啶、顺铂等化疗药物的治疗效果有关，可以通过检测患者该基因的表达水平指导临床胃癌化疗用药，提高疗效。据此，我们提出PITX1基因检测可以应用于胃癌预后判定与化疗耐药评估。从而可以精确地预测胃癌预后，并且可以基于预测的预后有效地建立最佳的个体治疗方案，以显著减少由胃癌引起的死亡。进一步地，我们公开了用于检测PITX1表达量的试剂（包括但不限于）选自：对PITX1具有检测特异性的探针、基因芯片或PCR引物。更为具体地，在本专利技术中我们公开了对PITX1采用免疫组化方法检测。利用免疫组化方法检测中我们所采用的检测试剂主要是由PITX1多克隆抗体、HRP标记二抗和组化试剂盒DAB显色剂组成。其中多克隆抗体具体来说是指1:200(Abcam，兔源性，ab72640)，HRP标记二抗是指DAKO、K5007即用型，组化试剂盒DAB显色剂是指DAKO、K5007,1:100。试剂盒中包含有检测生物样品中检测PITX1表达量的试剂，用于该检测的生物样品为福尔马林固定和/或石蜡包埋的胃癌组织。所述的检测试剂盒，通过以下步骤用于胃癌的预后判断：（a）.检测生物样品中的PITX1表达量，（b）.根据（a）中检测到的PITX1表达量将结果分为低表达（或者为不表达）和高表达两种，（1）PITX1不/低表达患者：5-FU化疗同时辅以PITX1基因治疗（PITX1的引入并不会诱发胃正常上皮细胞毒性），同时因其预后差，要密切随访病人，及时复查相应的肿瘤指征及PDCD5的表达水平，合理调整化疗的剂量时间；（2）PITX1高表达患者：预后虽较不/低表达患者好，但其对5-FU易耐药，故一旦发现控制效果不明显，应及时更换其他化疗药物。这里所说的低表达是指阴性、假阳性和弱阳性，高表达是指阳性和强阳性。由于胃癌细胞PITX1基因的表达水平与5氟尿嘧啶、顺铂等化疗药物的作用效果有关，可以通过检测患者该基因的表达水平指导临床制定个体化的化疗方案，提高疗效。采用本专利技术公开的技术方案后，可以通过对胃癌预后预测和胃癌化疗耐药评估进行标记，并利用免疫组化化学技术检测PITX1基因的表达水平，从而获得预测胃癌预后和化疗耐药的情况，且PITX1基因的引入方式简单，整个预测评估简便易行，可行性高。附图说明图1为Kaplan-Meier（KM）分析PITX1低表达和高表达组与预后的相关性，结果图。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面我们结合具体的实施例和附图对本专利技术进行进一步的阐述，但值得注意的是本专利技术的实施不仅限于此。本专利技术所用试剂和原料均市售可得或者可以按照文献方法制备。本专利技术实施例中未注明的具体条件的试验方法均按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件。实施例1PITX1表达量的免疫组化检测方法1.手术切除的胃癌标本，中性福尔马林固定后切成厚度为2-3mm的组织块，石蜡包埋，切片，厚度为3-4mm；2.烤片：65℃,1~2小时；3.切片脱蜡至水：首先将切片置入二甲苯溶液I中处理15min，取出后再次置入二甲苯溶液II，并停留15min，然后将切片取出并置入无水乙醇I中5min，取出再次置入无水乙醇II停留5min后，取出并置入85%的乙醇处理5min，而后取出置入75%乙醇5min，最后将切片取出放入蒸馏水中清洗5min；4.抗原修复：组织切片置于盛满pH9.0的EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，自然冷却后将玻片置于pH7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；5.内源性过氧化物酶阻断：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育20min，将玻片置于pH7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；6.血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加山羊血清，使其均匀覆盖组织，室温封闭30min；这里的山羊血清是以PBS按照1:20（山羊血清:PBS）的体积比稀释后的山羊血清；7.一抗孵育：轻轻甩掉封闭液，以卫生纸将圈外液体擦拭干净，然后在圈内滴加按照1:200配置好的一抗PBS溶液，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜；8.二抗孵育：玻片置于pH7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片以卫生纸将圈外液体擦拭干净，然后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（HRP标记，1:2000）覆盖组织，室温孵育1小时。9.DAB显色：玻片置于pH7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片以卫生纸将圈外液体擦拭干净，然后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。10.复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。11.脱水封片：首先将切片放入75%的乙醇中处理6min，取出，并放入85%的乙醇中处理6min后，取出后放入无水乙醇中处理两次，每次6min，然后再将切片取出并放入二甲苯中处理两次，每次5min，至脱水透明后，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片后显微镜下观察染色情况、并进行评分；12.评分标准：（1）着色细胞数：放大倍数200的视野选5个，取平均值。<5%---0分，5~25%---1分，26~50%---2分，51~75%---3分，>75%---4分；（2）：着色强度：无色---0分，淡黄色---1分，棕黄色---2分，棕褐色---3分。两者分数相乘，得数即为阳性等级，具体如下：阴性（-）---0分，弱阳性（+）---1~4分，阳性（++）---5~8分，强阳性（+++）---9~12分。实施例2PITX1表达量与胃癌预后的关系采用实施例1中公开的方式，对174例胃癌患者的PITX1的表达水平进行检测，其中阴性、假阳性和弱阳性为低表达组，阳性和强阳性为高表达组，根据Kaplan-Meier（KM）分析PITX1低表达和高表达组与预后的相关性，结果如图1。结果表明，PITX1与预后有着明显本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用，其特征是，用于检测PITX1表达量的试剂选自：对PITX1具有检测特异性的探针、基因芯片或PCR引物。3.根据权利要求1所述的检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用，其特征是，对PITX1采用免疫组化方法检测。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊红，乔凤昌，沈小慧，李懿萍，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32