【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种双sgrna文库的构建方法及其应用。
技术介绍
1、sgrna文库作为一种高通量筛选工具，在医药靶点发现、筛选，动、植物育种、肉质优选等多种研究领域应用广泛。目前，这些研究领域使用的sgrna文库的载体质粒均以装载一条sgrna序列为主。由于sgrna序列具有一定的脱靶率，为保证编辑效率，一个基因一般会设计3-6条sgrna序列。所以，在sgrna文库中，针对一个基因就包含3-6编辑质粒，这表明基因数越多，文库的多样性越多，文库的构建难度及质量维持难度也越大。
2、sgrna文库构建完成后，需要经过慢病毒包装转换为文库病毒，然后转染到细胞中，构建成文库细胞pool(文库细胞池)。研究人员通过对细胞pool进行药物、压力等方法筛选，最终获得研究结果。sgrna文库库容量为理论多样性的100倍被认为是较优量。一方面，sgrna质粒文库库容太大会影响慢病毒包装质量；另一方面，随着sgrna文库库容的增多，相应细胞需求量也会变大，这增加了细胞培养成本的同时还延长了细胞pool的构建周期。
3、因此，如何降低库容量、简化构建流程是目前sgrna文库迫切需要解决的问题，是实现sgrna文库灵活应用的关键。双sgrna文库为解决这一问题提供了一个突破口。
4、有报道提供了一种构建成对sgrna crispr-cas9文库的方法(joana a.vidigalet al.,rapid and efficient one-step generation of paired grn
5、cn107090466a公开了一种双sgrna文库的构建方法，所述方法利用两轮或三轮golden gate拼装技术进行双sgrna文库构建，操作较为繁琐。所述方法均同样涉及到在sgrna载体池基础上再次编辑，这会影响后期sgrna文库的正确率及多样性。
6、由此可见，双sgrna文库的构建方法仍然需要不断优化。开发一种操作简单、高效的双sgrna文库构建方法并针对不同研究需求提供相应的应用策略，为实现双sgrna文库作为一种高通量筛选工具在各个研发领域的灵活应用具有重大意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种双sgrna文库的构建方法及其应用，所述构建方法可以针对不同应用目的设计出不同的构建方案，有效降低时间、物料成本，实现双sgrna文库的精准、高效合成。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种双sgrna文库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
4、(a)分别合成带有sgrna序列的正向引物池(sgrna1 pool)和反向引物池(sgrna2pool)；
5、(b)以带有“grna scaffold-启动子2”元件序列的质粒作为模板，以步骤(a)所述正、反向引物池作为引物进行pcr扩增，获得带有“sgrna1-grna scaffold-启动子2-sgrna2”元件序列集合的pcr产物；
6、(c)将步骤(b)所述pcr产物通过重组连接的方法连接在目的载体的sgrna启动子1和grna scaffold元件之间，获得带有“启动子1-sgrna1-grna scaffold-启动子2-sgrna2-grna scaffold”元件组合的初代双sgrna重组质粒集合；
7、(d)将步骤(c)所述初代双sgrna重组质粒集合通过电穿孔转化的方式转入电穿孔转化专用的大肠杆菌感受态细胞，然后，将所述大肠杆菌感受态细胞涂布于带有抗生素的固体培养基上，置于30℃培养箱进行过夜培养；次日，将生长出的菌落收集在一起进行质粒抽提，所得质粒集合即为双sgrna质粒文库(双sgrna文库)。
8、优选地，所述正向引物池和反向引物池的展示形式包括单条引物形式、引物矩阵式排列形式、引物混合池形式或其中两者的组合形式。
9、优选地，所述正向引物池和反向引物池在合成前还包括如下序列设计步骤：
10、(1)将设计好的所有sgrna序列分成两组，其中一组sgrna序列(sgrna1)左侧添加与目的载体正向重组的重组臂序列，右测添加与扩增模板正向重组的重组臂序列，作为pcr扩增模板的正向引物池(sgrna1 pool)；
11、(2)另一组sgrna序列(sgrna2)首先进行序列反向互补，获得其反向序列，在sgrna反向序列的左侧添加与目的载体反向重组的重组臂序列，右侧添加与扩增模板反向重组的重组臂序列，作为pcr扩增模板的反向引物池(sgrna2 pool)。
12、优选地，所述目的载体为crispr编辑载体，包括但不限于crispr敲除载体、crispr激活载体、crispr抑制载体；所述目的载体还包含一个启动sgrna表达的启动子2元件和一个grnascaffold元件。
13、步骤(c)中在pcr扩增产物集合与目的载体重组连接之前，目的载体需要用限制性内切酶进行线性化；线性化位点应位于启动子2元件序列和grna scaffold元件序列之间。
14、优选地，所述目的载体中启动sgrna表达的启动子2包括真核表达启动子或原核表达启动子；更优选地，所述真核表达启动子为u6 promoter(u6启动子)、h1 promoter(h1启动子)。
15、步骤(b)中，带有“grnascaffold-启动子2”元件序列的载体质粒构建步骤包括：
16、(b1)在“grna scaffold-启动子2”序列的前端和末端分别添加与克隆载体puc57-ccdb/kan进行重组连接的重组臂序列；
17、(b2)通过基因合成pcr的方法进行序列合成及扩增获得带有重组臂序列的“grnasca本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双sgRNA文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述正向引物池和反向引物池的展示形式包括单条引物形式、引物矩阵式排列形式、引物混合池形式或其中两者的组合形式。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述正向引物池和反向引物池在合成前还包括如下序列设计步骤：
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述目的载体为CRISPR编辑载体，包含一个启动sgRNA表达的启动子2元件和一个gRNA scaffold元件。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述启动sgRNA表达的启动子2包括真核表达启动子或原核表达启动子；
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述“gRNA scaffold-启动子2”元件序列由gRNA scaffold元件序列与启动子2元件序列之间通过一段短的转录中止序列连接在一起。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述启动子2元件序列与目的载体上的启动子1元件序列不同。
...【技术特征摘要】
1.一种双sgrna文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述正向引物池和反向引物池的展示形式包括单条引物形式、引物矩阵式排列形式、引物混合池形式或其中两者的组合形式。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述正向引物池和反向引物池在合成前还包括如下序列设计步骤：
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述目的载体为crispr编辑载体，包含一个启动sgrna表达的启动子2元件和一个grna scaffold元件。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述启动sgrna表达的启动子2包括真核表达启动子或原核表达启动子；
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述“grna scaffold-启动子2”元件序列由grna scaffold元件序列与启动子2元件序列之间通...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘海虹，黄国帅，柳伟强，申姝茵，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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