检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法，本发明专利技术属于基因检测技术，扩增引物利用F8基因的序列信息设计65对PCR引物，通过PCR靶向扩增F8基因目标区域，扩增区域覆盖F8基因外显子编码区的99.5%。所述方法将多重PCR靶向扩增结合Ion torrent PGM高通量测序技术，实现多个样品的同时并行检测，提高了F8基因突变的检测范围和通量，缩短了检测周期，降低成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于体外基因检测领域，尤其涉及一种检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法
技术介绍
血友病(hemophilia)是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，患者由于凝血因子基因突变而导致凝血因子浓度下降或缺乏，从而造成凝血时间延长、轻微创伤后有出血倾向性。根据缺乏凝血因子的不同，临床上分为血友病A(hemophiliaA,HA)和血友病B(hemophiliaB,HB)。其临床表现主要为自发性、轻微外伤后出血难止或创伤、手术后严重出血等。出血的部位常见于负重的大关节(如膝、肘、踝、腕、髂、肩等)和肌肉/软组织，也可表现为内脏出血(如腹腔内、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等)、皮肤、黏膜出血(如皮肤淤血、鼻出血、口腔出血、牙龈出血等)。由于凝血因子Ⅷ(Ⅷ因子)和凝血因子Ⅸ(Ⅸ因子)的编码基因位于X染色体上，因此大多数血友病患者分布于男性，男性人群中血友病A和B的发病率分别约为1/5000和1/30000。其中，血友病A(hemophiliaA,HA)是最常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，由于FVIII的遗传性缺陷或缺乏所致，从而引起凝血功能障碍，发病率在男性中约为1/5000，女性通常为携带者，约60％患者有遗传病家族史。患者常常发生自发性或者外伤后出血不止，反复关节出血往往导致关节畸形，重要脏器出血可危及生命，目前尚无有效的根治方法，患者主要输注FVIII制品或新鲜全血预防和治疗出血。由于HA的危害性、遗传性及终生性，有必要开展HA的基因检测，为临床干预和遗传咨询提供依据。遗传学研究表明血友病A主要由F8基因突变引起；该基因位于X性染色体长臂末端((Xq28,chrX:154,064,070-154,250,998,inhg19)，其长度约有186kb并转录形成大约9kb的mRNA；该基因含有26个外显子(exon)，各外显子的大小不一，范围在69bp至3106bp之间。F8基因结构复杂，突变种类多，包括基因点突变、缺失、插入和倒位等，可能涉及整个基因，几乎覆盖了所有外显子的区域，因此特异性检测F8基因突变较为困难。很多年来，F8基因的复杂性导致很难对F8基因进行有效地突变分析。直到1991年，Higuchi等人首次使用变性梯度凝胶电泳法(denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)以分析F8基因的整个编码区，在29个轻度或中度血友病A患者(包括15名德国人和14名日本人)中发现25名(86％)患者F8基因致病突变，而在重度血友病A患者中仅发现53％的患者F8基因致病突变。在1998年，Liu等首先基于LD-PCR技术建立了Inv22突变检测方法，随后Bagnall等在2002年基于LD-PCR技术建立了Inv1突变检测方法，这两种方法一直沿用至今。随后，多种突变筛查方法，如单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)、构象敏感凝胶电泳(conformationsensitivegelelectrophoresis)、DGGE和化学裂解错配(chemicalcleavagemismatch)分析方法，被使用于许多实验室。但这些分析方法仍只能检出的血友病A患者中80-90％的F8基因突变。对F8基因的直接测序(PCR扩增+Sanger测序)，并且针对血友病A患者的F8基因突变检出率可达97％。最近几年随着二代测序技术的发展，二代测序技术也逐渐在各实验室使用并应用于血液疾病的遗传检测分析。目前，对PCR产物进行直接Sanger测序是常用的F8基因检测方法，虽然该方法更为准确，但测序工作量巨大、效率低，对操作人员要求较高，限制了该方法的大规模临床应用，仅能在有条件的实验室开展。当前，CN102230002A公开了一种检测血友病致病基因F8基因和F9基因是否发生突变的试剂盒，但其在扩增F8基因过程中所需要使用的引物组达24对，每对引物需要单独扩增，虽然较为准确，但方法过于繁琐，反应体系需要后续纯化，再结合Sanger进行后续处理，检测成本过高、效率低、分析困难。蔡晓红等(女性血友病AFVIII基因的双重杂合突变一例基因分析，《血栓与止血学》，2005年，第11卷第02期，52-56页)采用的方法与CN102230002A类似，也有类似的缺陷。第二代测序技术(next-generationsequencing,NGS)具有高通量、快速、准确和成本低的优点，可实现多样本、多个基因、多外显子的同时检测。其中，LifeTechnologies公司的IontorrentPGM高通量测序平台是其中的代表，它是基于半导体芯片的新一代革命性测序技术，使用一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池；当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时会释放出一个H+，反应池中的pH值发生变化，位于池下的离子感受器感受到此信号，把化学信号直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。IonTorrent测序平台原理不同于其他第二代测序技术，不属于核酸标记、荧光检测的生化技术，相比其他测序技术，更简单、经济，具有强大的扩展性。在上千万个纳米孔中，同时对上百万的序列进行大规模平行测序，此项技术的产生摆脱了一代测序技术效率低，费时费力的特点。因此，IontorrentPGM测序技术可以对PCR产物进行直接测序，而不需要片段化处理，而且采用标签技术，不需要对每个样本单独建库，可以显著提高检测通量，降低单个样品的检测成本。目前还未有将多重PCR技术和IontorrentPGM测序技术结合，并将其应用于F8基因检测的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服以上不足，将多重PCR技术和IontorrentPGM测序技术结合，并将其应用于F8基因检测。本专利技术通过设计了一组多重的引物，结合多重PCR技术，实现了对F8基因26个外显子编码区的同步扩增富集，大大简化了实验操作；再结合标签技术，使多个样本混合成一个文库通过IonTorrentPGM测序文库构建环节同时处理，大大简化了实验操作，最终每个样本的检测结果可以通过其独特的标签序列找回，实现多样本平行测序，提高了检测效率，降低了检测成本。而在本专利技术的优化PCR引物设计，采用65个PCR反应可以在单管中同步扩增获得F8基因全部外显子序列及侧翼内含子序列，与其它目标区域捕获技术(如芯片捕获技术)相比，该方法操作更为简单，成本较低，而且结合IonTorrent半导体测序技术后更为节约了检测时间和检测成本，弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷本本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的引物组，其特征在于，所述PCR引物共65对，分别如下：用于扩增F8基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；用于扩增F8基因内含子1到外显子2的引物，其正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；用于扩增F8基因外显子2到内含子2的引物，其正向引物如SEQ ID NO:5所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；用于扩增F8基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；用于扩增F8基因内含子3到外显子4的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向引物如SEQ ID NO:10所示；用于扩增F8基因外显子4到内含子4的引物，其正向引物如SEQ ID NO:11所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；用于扩增F8基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQ ID NO:13所示，反向引物如SEQ ID NO:14所示；用于扩增F8基因内含子5到内含子6的引物，其正向引物如SEQ ID NO:15所示，反向引物如SEQ ID NO:16所示；用于扩增F8基因内含子6到外显子7的引物，其正向引物如SEQ ID NO:17所示，反向引物如SEQ ID NO:18所示。用于扩增F8基因外显子7到内含子7的引物，其正向引物如SEQ ID NO:19所示，反向引物如SEQ ID NO:20所示。用于扩增F8基因内含子7到外显子8的引物，其正向引物如SEQ ID NO:21所示，反向引物如SEQ ID NO:22所示。用于扩增F8基因外显子8到内含子8的引物，其正向引物如SEQ ID NO:23所示，反向引物如SEQ ID NO:24所示。用于扩增F8基因内含子8到外显子9的引物，其正向引物如SEQ ID NO:25所示，反向引物如SEQ ID NO:26所示。用于扩增F8基因外显子9到内含子9的引物，其正向引物如SEQ ID NO:27所示，反向引物如SEQ ID NO:28所示。用于扩增F8基因内含子9到外显子10的引物，其正向引物如SEQ ID NO:29所示，反向引物如SEQ ID NO:30所示。用于扩增F8基因内含子10到外显子11的引物，其正向引物如SEQ ID NO:31所示，反向引物如SEQ ID NO:32所示。用于扩增F8基因外显子11到内含子11的引物，其正向引物如SEQ ID NO:33所示，反向引物如SEQ ID NO:34所示。用于扩增F8基因内含子11到内含子12的引物，其正向引物如SEQ ID NO:35所示，反向引物如SEQ ID NO:36所示。用于扩增F8基因外显子12到内含子12的引物，其正向引物如SEQ ID NO:37所示，反向引物如SEQ ID NO:38所示。用于扩增F8基因内含子12到外显子13的引物，其正向引物如SEQ ID NO:39所示，反向引物如SEQ ID NO:40所示。用于扩增F8基因外显子13到内含子13的引物，其正向引物如SEQ ID NO:41所示，反向引物如SEQ ID NO:42所示。用于扩增F8基因内含子13到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:43所示，反向引物如SEQ ID NO:44所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:45所示，反向引物如SEQ ID NO:46所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:47所示，反向引物如SEQ ID NO:48所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:49所示，反向引物如SEQ ID NO:50所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:51所示，反向引物如SEQ ID NO:52所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:53所示，反向引物如SEQ ID NO:54所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:55所示，反向引物如SEQ ID NO:56所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:57所示，反向引物如SEQ ID NO:58所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:59所示，反向引物如SEQ ID NO:60所示。用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQ ID NO:61所示，反向引物如SEQ ID NO:62所示。用于扩增F8...

【技术特征摘要】
1.用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的引物组，其特征在于，所述PCR引物共65
对，分别如下：
用于扩增F8基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQIDNO:1所示，反向引物
如SEQIDNO:2所示；
用于扩增F8基因内含子1到外显子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:3所示，反向引物
如SEQIDNO:4所示；
用于扩增F8基因外显子2到内含子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:5所示，反向引物
如SEQIDNO:6所示；
用于扩增F8基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQIDNO:7所示，反向引物
如SEQIDNO:8所示；
用于扩增F8基因内含子3到外显子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:9所示，反向引物
如SEQIDNO:10所示；
用于扩增F8基因外显子4到内含子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:11所示，反向引
物如SEQIDNO:12所示；
用于扩增F8基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQIDNO:13所示，反向引
物如SEQIDNO:14所示；
用于扩增F8基因内含子5到内含子6的引物，其正向引物如SEQIDNO:15所示，反向引
物如SEQIDNO:16所示；
用于扩增F8基因内含子6到外显子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:17所示，反向引
物如SEQIDNO:18所示。
用于扩增F8基因外显子7到内含子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:19所示，反向引
物如SEQIDNO:20所示。
用于扩增F8基因内含子7到外显子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:21所示，反向引
物如SEQIDNO:22所示。
用于扩增F8基因外显子8到内含子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:23所示，反向引
物如SEQIDNO:24所示。
用于扩增F8基因内含子8到外显子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:25所示，反向引
物如SEQIDNO:26所示。
用于扩增F8基因外显子9到内含子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:27所示，反向引
物如SEQIDNO:28所示。
用于扩增F8基因内含子9到外显子10的引物，其正向引物如SEQIDNO:29所示，反向引
物如SEQIDNO:30所示。
用于扩增F8基因内含子10到外显子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:31所示，反向
引物如SEQIDNO:32所示。
用于扩增F8基因外显子11到内含子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:33所示，反向
引物如SEQIDNO:34所示。
用于扩增F8基因内含子11到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:35所示，反向
引物如SEQIDNO:36所示。
用于扩增F8基因外显子12到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:37所示，反向
引物如SEQIDNO:38所示。
用于扩增F8基因内含子12到外显子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:39所示，反向
引物如SEQIDNO:40所示。
用于扩增F8基因外显子13到内含子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:41所示，反向
引物如SEQIDNO:42所示。
用于扩增F8基因内含子13到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:43所示，反向
引物如SEQIDNO:44所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:45所示，反向
引物如SEQIDNO:46所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:47所示，反向
引物如SEQIDNO:48所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:49所示，反向
引物如SEQIDNO:50所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:51所示，反向
引物如SEQIDNO:52所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:53所示，反向
引物如SEQIDNO:54所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:55所示，反向
引物如SEQIDNO:56所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:57所示，反向
引物如SEQIDNO:58所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:59所示，反向
引物如SEQIDNO:60所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:61所示，反向
引物如SEQIDNO:62所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:63所示，反向
引物如SEQIDNO:64所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:65所示，反向
引物如SEQIDNO:66所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:67所示，反向
引物如SEQIDNO:68所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:69所示，反向
引物如SEQIDNO:70所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:71所示，反向
引物如SEQIDNO:72所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:73所示，反向
引物如SEQIDNO:74所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:75所示，反向
引物如SEQIDNO:76所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:77所示，反向
引物如SEQIDNO:78所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:7...

【专利技术属性】
技术研发人员：许争峰，马定远，刘刚，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏;32