本发明专利技术提供了用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组以及使用所述引物组扩增样品中多个目标DNA序列的方法，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物：每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)与目标序列之外的序列不发生扩增、(2)之间不形成二聚体、(3)不形成发卡结构；在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；在所述特异性序列的3’端有增加空间位阻的修饰，所述修饰不阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全匹配的模板的结合与延伸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸序列的捕获、富集与分析。更具体来说，本专利技术涉及基于多重PCR的目标序列富集方法。
技术介绍
全基因组测序可以获得全基因组水平范围的突变、插入、缺失以及结构变异。然而，由于基因组容量巨大，以30×进行测序就会产生接近100G的数据量。而肿瘤等相关的低突变频率测序则需要至少1000×的覆盖度，如果进行全基因组测序，则会产生3000G的数据量。这样规模的数据量除了会对数据的分析工作造成极大的困难，还会显著增加测序的成本，进而制约测序的应用。为了解决这个难题，目标区域捕获技术应运而生。目标区域捕获技术是指通过特定的技术手段定向捕获目标区域的核酸序列，然后进行建库测序，以达到在对目标区域进行深度测序的目的的同时使得测序成本大大降低。PCR是一种常见的用于富集目标区域的技术，更为常见的是利用多重PCR技术一次性的捕获多个目标区域。多重PCR适用于热点区域或者长度较小的目标区域的捕获。制约多重PCR技术应用的两个重要因素是非特异扩增和二聚体的产生。因此，本领域中需要能有效降低非特异扩增和二聚体产生的多重PCR技术出现。
技术实现思路
本专利技术提供了基于多重PCR扩增的目标序列富集方法，所述方法包括：兼容性多重PCR引物的筛选；进行第一轮特异性多重PCR扩增；进行第二轮通用引物扩增富集；回收产物并上机测序。因此，在第一方面，本专利技术提供了用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物，其中：a)每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所有特异性序列之间满足如下条件：(1)每个特异性序列与目标序列之外的序列不发生扩增，(2)特异性序列之间不形成二聚体，(3)特异性序列不形成发卡结构；b)在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；c)在所述特异性序列的3’端的碱基处有增加空间位阻的修饰，所述修饰不阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全匹配的模板的结合与延伸。在一个具体的实施方案中，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)所述特异性序列与目标区域的Tm-与非目标区域的Tm≥5℃，优选≥10℃；(2)所述特异性序列与目标区域的Tm-与其他特异性序列形成二聚体的Tm≥5℃，优选≥10℃；(3)所述特异性序列与目标区域的Tm-形成发卡结构的Tm≥5℃，优选≥10℃，优选Tm的值基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算。在本专利技术中，所述特异性序列的3’端的碱基处修饰包括在所述特异性序列的3’端-2、-3位碱基、核糖或磷酸二酯键上；在优选的实施方案中，所述特异性序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％，即有三个或三个以上的碱基为C或G，所述特异性序列的3’端的碱基处修饰还包括在所述特异性序列的3’端-4位碱基、核糖或磷酸二酯键处。即，在优选的实施方案中，在所述特异性序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％的情况下，即有三个或三个以上的碱基为C或G，所述特异性序列的3’端的碱基处修饰还包括在所述特异性序列的3’端-2、-3、-4处位碱基、核糖或磷酸二酯键处。在一个具体的实施方案中，所述增加空间位阻的修饰选自：脱氧次黄嘌呤(dI)、脱氧尿嘧啶(dU)、5-Methyl dC、2′-O-Me-dC、磷酸基团、硫代基团、地高辛、生物素、AminolinkerC7、BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、TAMRA、烷基基团、氟代基团、氨基基团和Thiol-C3S-S。在一个具体的实施方案中，所述3’端的碱基处增加空间位阻的修饰包括3’端-1、-2、-3位碱基处的硫代修饰。在一个具体的实施方案中，所述特异性序列的3’端的5个碱基的GC含量大于50％，在所述特异性序列的3’端-4位碱基处有硫代修饰。在一个具体的实施方案中，所述特异性引物序列有一致的热力学参数，优选Tm标准差≤5℃；更优选Tm标准差≤2℃；最优选Tm标准差≤1℃。Tm标准差是所述所有特异性引物序列与相应目标DNA序列之间的Tm的标准差。在第二方面，本专利技术提供了一种扩增样品中多个目标DNA序列的方法，所述方法包括：a)提供包含目标DNA序列和非目标序列的样本、本专利技术第一方面的引物组和与所述引物组中特异性引物5’端通用序列互补的通用引物对；b)以所述引物组中的特异性引物进行PCR反应，扩增所述样本中的目标DNA序列，所述PCR反应的退火温度按照从高到低的阶梯进行，例如在一个退火过程中使用等差的3个温度(例如60℃、59℃、58℃)进行退火；c)以所述通用引物对再次扩增步骤b)中的扩增产物，进一步富集所述扩增产物。在一个具体的实施方案中，所述方法还包括步骤d)对步骤c)得到扩增产物进行测序。在一个具体的实施方案中，所述方法还包括步骤b’)：回收步骤b)中富集的扩增产物。在一个具体的实施方案中，所述回收是通过采用磁珠对第一轮PCR反应产物进行片段筛选和纯化，去除目标区域外的大片段、基因组DNA、引物二聚体、引物和其他反应成分，得到目标区域序列的PCR产物。在一个具体的实施方案中，所述多个退火温度是3个温度，例如60℃、59℃、58℃。具体实施方式本专利技术提供了基于多重PCR扩增的目标序列富集方法，所述方法包括：兼容性多重PCR引物的筛选；第一轮特异性多重PCR扩增；第二轮通用引物扩增富集；回收产物并上机测序，达到检测的目的。因此，本专利技术提供了用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组以及使用所述引物组扩增样品中多个目标DNA序列的方法。在本专利技术中，本专利技术的多重PCR引物组中的引物优选具有如下特性：1.具有特异性，即在所述多重PCR体系中，同一反应体系内的所有引物，除了目标序列之外，不会扩增其他非目标序列。所述具有特异性的引物的设计方法是：首先对任意一对引物进行全基因组in sillco扩增分析，将预测到的扩增产物与目标扩增产物进行比较，如果预测产物中有非目标产物，并且这些非目标预测产物和目标产物之间的热力学参数相近，那么判定这对引物有非特异扩增；如果这些非目标预测产物和目标产物的热力学参数相差较大，那么可认为不会产生非特异扩增。热力学参数相差的判定的标准为：Tm(与目标产物)-Tm(与非目标产物)≥5℃，优选Tm(与目标产物)-Tm(与非目标产物)≥10℃；另外，不同的热力学计算方法以及参数会对计算结果有影响，本专利技术中优选基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算；2.无二聚体产生，即在所述多重PCR体系中，同一反应体系内的所有引物两两之间不能形成稳定的二聚体，判定的标准为：Tm(与目标产物)-Tm(二聚体)≥5℃，优选Tm(与目标产物)-Tm(二聚体)≥10℃；另外，不同的热力学计算方法以及参数会对计算结果有影响，本专利技术中优选基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算；3.无发卡结构产生，即在所述多重PCR体系中任何引物自身都不形成稳定的发卡结构，判定的标准为：Tm(与目标产物)-Tm(发卡结构)≥5℃，优选Tm(与目标产物)-Tm(发卡结构)≥10℃；另外，不同的热力学计算方法以及参数会对计算结果有影响，本专利技术中优选基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算；4本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物，其中：a)每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所有特异性序列之间满足如下条件：(1)每个所述特异性序列与目标序列之外的序列不发生扩增；(2)所述特异性序列之间不形成二聚体；(3)所述特异性序列不形成发卡结构；b)在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；c)在所述特异性序列的3’端的碱基处有增加空间位阻的修饰，所述修饰不阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全匹配的模板的结合与延伸。
【技术特征摘要】
1.用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物，其中：a)每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所有特异性序列之间满足如下条件：(1)每个所述特异性序列与目标序列之外的序列不发生扩增；(2)所述特异性序列之间不形成二聚体；(3)所述特异性序列不形成发卡结构；b)在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；c)在所述特异性序列的3’端的碱基处有增加空间位阻的修饰，所述修饰不阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全匹配的模板的结合与延伸。2.权利要求1的引物组，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)所述特异性序列与目标区域的Tm-与非目标区域的Tm≥5℃，优选≥10℃；(2)所述特异性序列与目标区域的Tm-与其他特异性序列形成二聚体的Tm≥5℃，优选≥10℃；(3)所述特异性序列与目标区域的Tm-形成发卡结构的Tm≥5℃，优选≥10℃，优选的Tm值基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算。3.权利要求1的引物组，所述增加空间位阻的修饰选自：脱氧次黄嘌呤(dI)、脱氧尿嘧啶(dU)、5-Methyl dC、2′-O-Me-dC、磷酸基团、硫代基团、地高辛、生物素、AminolinkerC7、BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、TAMRA、烷基基团、氟代基团、氨基基团和Thiol-C3S-S。4.权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：屈武斌，蔡万世，易建明，杭兴宜，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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