一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法，所述方法包括：1)设计茎环形接头序列；2)将基因组DNA超声打断，或直接采用cfDNA进行末端修复和加A；3)连接反应：颈环结构的接头与所述加A的DNA片段进行连接反应，并纯化连接产物；4)对所述纯化的连接产物进行Bisulfite转化实验，C碱基可以转化为U，而对于mC无变化，形成带有颈环接头的正负插入片段的环形结构；5)文库的产生，使用探针杂交延伸反应获得延伸产物；6)上机测序，对所述延伸产物进行测序。

【技术实现步骤摘要】
一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法
本专利技术属于生物
，更具体而言，本专利技术涉及一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法。
技术介绍
DNA甲基化是一种对正常发育和很多疾病(肿瘤)发生机制的重要转录调控机制，属于表观遗传修饰之一，具体指的是真核生物以SAM等作为甲基供体，在DNA甲基转移酶的作用下选择性地将甲基转移到DNA中CG两个核苷酸的特定胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶。尤其是在CpG双核苷酸富集的区域内，GC的含量超过55％，被称为CpG岛。在多个基因的周围有一些成簇的CpG岛，通过转录调控来调节基因的表达。近年来，各种癌症成为人类健康的极大威胁之一。研究表明，不仅遗传学的改变能够触发和引起癌症，表观遗传学对癌症的发生发展起着重要作用。与正常细胞相比，癌细胞中基因组甲基化水平整体偏低，然而基因的启动子区呈现高甲基化趋势。在肿瘤的相关研究中表明肿瘤抑制基因启动子区往往发生DNA高甲基化，发生甲基化的DNA改变染色质结构、DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式，来抑制抑癌基因的表达，当抑癌功能受到抑制，细胞重新进入生长周期，最终导致肿瘤发生。然而，癌症相关基因启动子区则呈现出低甲基化。DNA甲基化属于基因表达的调控因子之一，肿瘤抑癌基因甲基化的增加是很多肿瘤发生的一个早期事件，通过检测某些癌细胞或组织中基因的特定性甲基化的改变，可以及早地发现肿瘤的发生。然而对于癌细胞或者组织来讲，获取材料有限以及会对患者带来有创性伤害，随着近年来液体活检技术的兴起，它成为甲基化检测取材的首选技术。因为ctDNA上携带有与肿瘤发生相关的特定甲基化类型，成为对肿瘤早期诊断可靠的生物标志物。为了全面地检测到甲基化信息，全基因组亚硫酸氢盐测序可以实现高分辨率且全面的甲基化模式检测，但在构建文库时，通常需要5μg以上的基因组DNA。因此，对于起始量有限的样本，这种甲基化检测方法很受限制，同时要求较高的测序深度，高额的检测成本也成为此技术得以广泛应用的一个重要限制条件。相比之下，padlock探针法与亚硫酸氢盐测序相结合的技术，需要几十-几百ng的DNA量就可以进行检测，与分析整个基因组不同，这种方法聚焦于基因组的特定区域。但是padlock探针法也有其自身的局限性，不能区分CpG位点上发生的是突变还是非甲基化Bisuffite转化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法。本专利技术提供了一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法，所述方法包括：1)设计茎环形接头序列，所述茎环形接头序列符合：(1)接头茎部互补配对部分的碱基对数为8-15对，优选12对，(2)接头的环状部分不能形成4个或4个以上碱基的互补配对，(3)接头的环状部分和茎部配对的碱基数小于4，(4)颈环结构核酸序列中不能与人基因组序列和经Bisulfite转化后文库有连续10个及10个以上的碱基互补配对，(5)茎环结构接头上所有的胞嘧啶碱基均为5-甲基胞嘧啶；2)将基因组DNA超声打断，或直接采用cfDNA进行末端修复和加A；3)连接反应：颈环结构的接头与所述加A的DNA片段进行连接反应，并纯化连接产物；4)对所述纯化的连接产物进行Bisulfite转化实验，C碱基可以转化为U，而对于mC无变化，形成带有颈环接头的正负插入片段的环形结构；5)文库的产生，使用探针杂交延伸反应获得延伸产物，探针序列结构如下：5’-3’方向：与Bisulfite转化后的目标序列互补序列(个数：25-35，优选30个)+AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC+GGGGGGGGGG+CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT+NNNNNN(分子标签)+与Bisulfite转化后的目标序列互补序列(个数：25-35，优选30个)；6)上机测序，对所述延伸产物进行测序，优选对所述延伸引物扩增后进行测序。在一个实施方案中，所述环形结构接头序列如下(5’-3’)：C*GTGTAGGC*C*TGAATC*GAC*TAGTC*AAC*AGGC*C*TAC*AC*GT,其中C*代表该碱基有甲基化修饰。在一个实施方案中，探针与目标区域互补的序列的Tm值为55-85度，更加优选的，65-75度。在一个实施方案中，对与目标区域互补的序列，设计探针时，对于CpG碱基时，把C改为C/T这两种简并碱基，探针上CG不超过3个，优选不含CG的序列；CA、CT、CC上的C改为T,其他位置上的A、T和G都按照碱基互补配对原则进行设计；探针与目标序列互补序列的TM值范围在65℃-85℃，优选75℃；探针的长度为90-120nt，优选100nt。在一个实施方案中，分子标签在颈环部分。由于本方法可以同时检测到两条互补链的信息，因此通过一次建库既能检测到突变同时也可以检测到甲基化信息，不但节约了样本，而且也极大地节省了建库和上机测序成本。本方法不但可以检测人、动植物基因组的甲基化信息，同时也可以检测微生物等甲基化信息，应用范围极为广泛。附图说明通过以下附图对本专利技术进行说明：图1示出了建库流程；图2示出了癌症DNA甲基化标记物结果及分析。具体实施方式在本专利技术中，甲基化建库流程，建库流程图见图1：1.设计环形接头序列的要点：(1)互补配对部分的碱基对数为8-15对，优选12对。(2)环状部分不能形成互补配对(3)环状部分的碱基不能与颈部配对的12对碱基之间有任何的配对。(4)颈环结构序列中没有与基因组匹配的碱基。(5)分子标签可以设计在颈环部分，由于标签种类较多，但是会干扰颈环结构的形成，因此标签不建议设计在颈环部分。环形结构接头序列如下(5’-3’)：C*GTGTAGGC*C*TGAATC*GAC*TAGTC*AAC*AGGC*C*TAC*AC*GT,C*代表该碱基有甲基化修饰2.末端修复和加A2.1将总量为30ng的cfDNA样品完全转移至PCR管中，按如下表格配置反应体系(此操作需在冰盒上进行)：表1末端修复、3’端加“A”体系组分量cfDNAfragment50μlEndRepair&A-TailingBuffer7μlEndRepair&A-TailingEnzymeMix3μl总体积60μl2.2使用移液器吹打混匀(避免剧烈震荡混匀)，将PCR管放回冰盒上备用；2.3运行PCR程序，设置PCR仪参数如下：Heatlid85℃20℃维持30min65℃维持30min4℃维持∞2.4程序运行完成后立即进行下步连接反应。3.连接反应：颈环结构的接头与修复好的cfDNA进行连接反应，这样设计的目的在于可以同时检测到正负链，起到正负链校对的作用。同时可以区分点突变和由Bisuffite转化的碱基。3.1在上述step2反应的PCR管中，按如下表格配置反应体系(此操作需在冰盒上进行)：表2连接体系组分量来自step2反应结束的样品60μl环化接头(100uM)0.5μlNuclease-freewater9.5μlLigationBuffer30μlDNALigase10μl总体积110μl3.2轻轻吸打混匀6次，避免产生气泡，然后短暂离心；3.3运行PCR仪程序(要求无热盖)，设置PCR仪参数如下：Heatlidoff本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法，所述方法包括：1)设计茎环形接头序列，所述茎环形接头序列符合：(1)接头茎部互补配对部分的碱基对数为8‑15对，(2)接头的环状部分不能形成4个或4个以上碱基的互补配对，(3)接头的环状部分和茎部配对的碱基数小于4，(4)颈环结构核酸序列中不能与人基因组序列和经Bisulfite转化后文库有连续10个及10个以上的碱基互补配对，(5)茎环结构接头上所有的胞嘧啶碱基均为5‑甲基胞嘧啶；2)将基因组DNA超声打断，或直接采用cfDNA进行末端修复和加A；3)连接反应：颈环结构的接头与所述加A的DNA片段进行连接反应，并纯化连接产物；4)对所述纯化的连接产物进行Bisulfite转化实验，C碱基可以转化为U，而对于mC无变化，形成带有颈环接头的正负插入片段的环形结构；5)文库的产生，使用探针杂交延伸反应获得延伸产物，探针序列结构如下：5’‑3’方向：第一与目标序列互补序列+AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC+GGGGGGGGGG+CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT+NNNNNN+第二与目标序列互补序列，NNNNNN表示分子标签；6)上机测序，对所述延伸产物进行测序，优选对所述延伸引物扩增后进行测序。...

【技术特征摘要】
1.一种使用镜像探针进行甲基化捕获测序的方法，所述方法包括：1)设计茎环形接头序列，所述茎环形接头序列符合：(1)接头茎部互补配对部分的碱基对数为8-15对，(2)接头的环状部分不能形成4个或4个以上碱基的互补配对，(3)接头的环状部分和茎部配对的碱基数小于4，(4)颈环结构核酸序列中不能与人基因组序列和经Bisulfite转化后文库有连续10个及10个以上的碱基互补配对，(5)茎环结构接头上所有的胞嘧啶碱基均为5-甲基胞嘧啶；2)将基因组DNA超声打断，或直接采用cfDNA进行末端修复和加A；3)连接反应：颈环结构的接头与所述加A的DNA片段进行连接反应，并纯化连接产物；4)对所述纯化的连接产物进行Bisulfite转化实验，C碱基可以转化为U，而对于mC无变化，形成带有颈环接头的正负插入片段的环形结构；5)文库的产生，使用探针杂交延伸反应获得延伸产物，探针序列结构如下：5’-3’方向：第一与目标序列互补序列+AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC+GGGGGGGGGG+CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT+NNNNNN+第二与目标序列互补序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁加龙，余越美，蔡万世，周波，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11