一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法。具体的，利用花生属叶绿体基因组筛选得到一个高突变区通过简单扩增和测序来解析花生属种间遗传关系。包括如下步骤：(1)根据已有数据库获取栽培种花生及其近缘物种叶绿体全基因组基因序列；(2)将多个物种叶绿体全基因组基因序列进行对比分析，锚定叶绿体全基因组范围内的高突变区域并进行注释；(3)对选定高突变区域进行引物设计，PCR扩增和一代测序后，构建系统发生树。本发明专利技术利用花生属的高突变区psbE‑petL，通过简单的扩增和构树，可以有效地解析花生属种间遗传关系，省时，省力和省费用，是有效解析花生属种间遗传关系上的一项重大突破，具有突出的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法。
技术介绍
栽培种花生种植面积广泛，但是遗传基础相对狭窄。因此，拓宽栽培种花生的种质资源遗传基础显得尤为重要。花生属包含了81个已命名的物种，野生种质资源丰富，优异资源基因丰富，在热带亚热带气候环境下有广泛的适应性。和栽培种花生相比，野生种质具有叶斑病、锈病、青枯病等抗病虫害基因，是用于花生品种改良的重要基因源。尽管有些种质资源并无栽培价值，但可根据不同的目的，通过杂交选育利用其有利基因，获得新种或达到改良现有栽培种的目的。揭示栽培种花生与花生区组其它野生种之间的亲缘关系是野生资源引入和遗传资源保存的重要参考。近年来，随着高通量测序技术的发展促进了基因组学分析和研究。但是，通过叶绿体全基因组序列去解析花生属种间系统进化关系需要经过建库、测序、原始数据过滤、组装和大数据分析等多步骤，最终完成基于叶绿体全基因组序列的系统进化树的构建。上述方法耗费的时间和费用较多，并且生物信息学分析较为复杂。因此，现在急需一种方法简单，所用时间短，效率高，费用低的解析花生属种间遗传关系的方法。
技术实现思路
为解决现有技术存在的不足，本专利技术提供一种方法简单，所用时间短，效率高，费用低的解析花生属种间遗传关系的方法。本专利技术的技术方案为：一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，利用花生属叶绿体基因组筛选得到一个高突变区，可通过简单扩增和测序来快速有效地解析花生属种间遗传关系。上述解析花生属种间遗传关系的有效简易方法，包括如下步骤：(1)根据已有数据库记录获取栽培种花生及其近缘物种叶绿体全基因组基因序列；(2)将多个物种叶绿体全基因组基因序列进行核苷酸多态性分析，锚定叶绿体全基因组范围内的高突变区域并进行注释；(3)对选定高突变区域进行引物设计，PCR扩增和一代测序后，构建系统发生树来解析花生属种间遗传关系。进一步的，所述步骤(2)中，利用VISTA软件使用通过500bp大小滑动窗口的计算不同窗口的核苷酸多样性比对，锚定叶绿体全基因组上的高核苷酸多样性域。进一步的，所述高突变区域为psbE-petL基因间隔区，所述psbE-petL基因间隔区的序列如序列表41所示，所述psbE-petL基因间隔区为花生属的DNAbarcode。进一步的，所述步骤(3)中，引物设计的过程中取高突变区域约总长500bp片段长度进行引物设计。进一步的，引物上游设计范围1-100bp，下游设计范围600-700bp，产物大小在500-700bp之间，退火温度58℃。进一步的，所述步骤(3)中，随机选取几个具有叶绿体全基因组的花生属的物种，通过DNA提取的方法将每个物种随机选取2-3粒完整种子，培养皿中浸种3-4d，待种子萌发出芽后置入培养盒，28℃下培养10-13d，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取花生叶片DNA。进一步的，所述步骤(3)中，PCR扩增的反应体系为MasterMix12.5μL、DNA模板0.5μL、ddH2O10μL、上游引物1μL、下游引物1μL。进一步的，所述步骤(3)中，PCR扩增的反条件为95℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸50s，33个循环，72℃再延伸7min。进一步的，通过一代测序方法，获得扩增片段序列。进一步的，所述步骤(3)中，利用MEGA软件对多个扩增序列片段构建系统关系树。本专利技术所达到的有益效果为：本专利技术通过锚定花生属各物种间特有的叶绿体基因组高突变区psbE-petL，即花生属的DNAbarcode，进行构建系统关系树与通过叶绿体全基因构建的系统关系树进行比对分析，得到了较为一致的结果。因此，证明了该花生属叶绿体基因组高突变区psbE-petL就可以用来解析花生属种间遗传关系。并且，本专利技术通过筛选花生属叶绿体基因组高突变区，仅仅通过简单的扩增和对比，可以有效地解析种间遗传关系，做到省时，省力和省费用，是解析花生属种间遗传关系上的一项重大突破，具有突出的现实意义。附图说明图1是利用叶绿体基因组高突变区域构建的系统关系树。图2是利用叶绿体全基因组构建的系统关系树。具体实施方式为便于本领域的技术人员理解本专利技术，下面结合实施例说明本专利技术的具体实施方式。实施例1大数据分析通过数据库现有数据及高通量测序和组装，获得到了4个栽培种花生的生物学类型(GenBankaccessionno.MG814006forvar.fastigiataWaldron,MG814007forvar.hirsuteKohler,MG814008forvar.hypogaeaL.和MG814009forvar.vulgarisHarz)和11个野生种的叶绿体全基因组(MK144818forA.monticola,MK144823forA.paraguariensis,MK144822forA.duranensis,MK144819forA.stenosperma,MK144820forA.batizocoi,MK144824forA.cardenasii,MK144826forA.helodes,MK144828forA.correntina,MK144827forA.hoehnei,MK144821forA.chacoensis,MK144829forA.和MK144825forA.villosa)序列，通过全基因组序列的对比和分析，得到候选高突变区域。具体的，通过500bp大小滑动窗口的核苷酸多样性比对，利用VISTA软件锚定叶绿体全基因组上的高突变区域。2验证实验2.1研究材料选用4份栽培种花生，花生属野生种11份。2.2引物的设计通过高通量数据的生物信息学分析获取花生叶绿体全基因组水平上高突变区域，即psbE-petL基因间隔区，如序列表41所示。该区域两端进行引物设计，总长593bp。引物设计用primerpremier6.0，上游设计范围1～100bp，下游设计范围600～700bp，产物大小593bp，退火温度58℃。引物合成信息见表1。表1引物合成信息2.3DNA的提取每份种质材料随机选取2-3粒完整种子，培养皿中浸种3-4d，待种子萌发出芽后置入培养盒，28℃下培养10-13d。使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,Beijing)提取花生叶片DNA。利用SuperGelRed(S-2001)进行凝胶电泳检测(USEverbrightInc，Suzhou，China)后，使用NanodropTM2000(ThermoScientific)分光光度计检测DNA完整性和纯度。所得栽培种4份DNA样品，野生种11份DNA样品，每份DNA样品保证单位浓度不少于50ng/μL，总质量大于2μg，放于-80℃冰箱保存备用。2.4PCR扩增及电泳检测用编号为20的引物扩增基因组DNA样品，反应体系总体积为25μL，含MasterMix12.5μL，DNA模板0.5μL，ddH2O10μL，上游引物1μL，下游引物1μL。反条件为95℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸50s，33个循环，72℃再延伸7min，4℃保存。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：利用花生属多个物种叶绿体基因组筛选得到一个高突变区，可通过简单扩增和测序来快速有效地解析花生属种间遗传关系。

【技术特征摘要】
1.一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：利用花生属多个物种叶绿体基因组筛选得到一个高突变区，可通过简单扩增和测序来快速有效地解析花生属种间遗传关系。2.根据权利要求1所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据已有数据库记录获取栽培种花生及其近缘物种叶绿体全基因组基因序列；(2)将多个物种叶绿体全基因组基因序列进行核苷酸多态性分析，锚定叶绿体全基因组范围内的高突变区域并进行注释；(3)对选定高突变区域进行引物设计，PCR扩增和一代测序后，构建系统发生树来快速有效地解析花生属种间遗传关系。3.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，利用VISTA软件使用500bp大小滑动窗口的计算不同窗口的核苷酸多样性，锚定叶绿体全基因组上的高核苷酸多样性域。4.根据权利要求2或3所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述高突变区域为psbE-petL基因间隔区，所述psbE-petL基因间隔区的序列如序列表41所示。5.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，引物设计的过程中取高突变区域约总长700bp片段长度进行引物设计。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娟，单世华，闫彩霞，赵晓波，李春娟，苑翠玲，孙全喜，
申请(专利权)人：山东省花生研究所山东省农业科学院花生工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37