一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒。该方法包括：步骤a.根据核酸突变位点设计数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物对能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料；步骤b.对所述核酸位点进行数字PCR扩增和进行扩增后微液滴荧光检测，根据所述微液滴荧光信号差异来确定核酸突变顺反式结构。本发明专利技术利用ddPCR技术对模板的单分子分散能力，实现了对基因突变的顺反式结构进行特异性检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒
本专利技术涉及数字PCR
，具体涉及一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒。
技术介绍
在基因突变中，当同一个基因的两个或多个突变位于相同等位基因上时为顺式突变，即两个或多个突变位于同一条染色体上；位于不同等位基因上时为反式突变，即两个或多个突变不都位于同染色体上。目前已有一些基因突变的顺反式结构被报道，而且其临床意义重要，不同的顺反式突变对临床治疗和用药指导具有不同的影响。例如，在肺癌靶向治疗中，使用奥希替尼后可能会发生耐药突变，其中表皮生长因子受体EGFR基因上的C797S突变已经明确为第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的耐药突变位点，而且临床前研究发现，如果EGFRT790M和C797S为反式突变，则对第一代和第三代EGFRTKI联合用药敏感，但如果为顺式突变，则对所有EGFRTKI耐药。因此，同一个基因的不同突变的顺反式结构对靶向治疗的敏感性可能有差异，检测基因突变的顺反式结构对于临床治疗及用药指导方面具有重要参考价值。随着精准医疗的到来，会有更多的顺反式突变被研究，并能够指导患者选择更佳的治疗方案。随着数字PCR发展，基于微液滴的数字PCR技术(ddPCR)在突变检测中凸显出极大优势，该技术基于微流控芯片，可生成数微米到数百微米的液滴，液滴的体积通常为皮升到纳升级别，可以包裹单分子。微液滴是由惰性油相通过生物相容性的表面活性剂包裹水相而产生，常见的生物化学可以在微液滴中实现。该技术优势如下：(1)灵敏度高，一个液滴可包含单个分子或细胞，在物理层面实现单分子级检测；(2)绝对定量，每次微流体芯片可生成数百万个微液滴，对逐个微液滴统计，通过泊松分布计算模板数量，可实现数字化绝对定量，结论可靠。目前，基于微液滴技术的研究工作和各种应用领域已发表在Cell、Nature、NatureBiotechnology、PNAS等高水平杂志上。
技术实现思路
本专利技术利用ddPCR技术对模板的单分子分散能力，实现了对基因突变的顺反式结构进行特异性检测。在一种方式中，本专利技术提供一种检测核酸突变顺反式结构的方法，所述方法包括：步骤a.根据核酸突变位点设计数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物对能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料；和步骤b.对所述核酸位点进行数字PCR扩增和进行扩增后微液滴荧光检测，根据所述微液滴荧光信号差异来确定核酸突变顺反式结构。在一种实施方式中，本专利技术提供一种检测核酸突变顺反式结构的试剂盒，所述试剂盒包括：用于扩增包含核酸突变位点的数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料。在一种实施方式中，所述核酸是DNA或RNA。在一种实施方式中，当所述核酸是RNA时，所述方法还包括将所述RNA逆转录成cDNA的步骤。在一种实施方式中，所述方法是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和C797S突变顺反式结构的方法。在一种实施方式中，所述方法是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和L858R突变顺反式结构的方法。在一种实施方式中，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和C797S突变顺反式结构的试剂盒，所述试剂盒包括用于能够同时扩增EGFR基因T790M突变和C797S突变的数字PCR扩增的引物对SEQIDNO：4:CACCTCCACCGTGCAGCT和SEQIDNO：5:TCTTTGTGTTCCCGGACATAG；以及检测EGFRC797S基因型上两种突变的探针SEQIDNO：1：TTCGGCAGCCTCC和SEQIDNO：2：CTTCGGCTCCCTCCT，两种探针标记同一种荧光；和检测EGFRT790M突变型探针SEQIDNO：3：ATGAGCTGCATGATGAG，该探针标记的荧光不同于检测EGFRC797S基因型上两种突变的探针标记的荧光。在一种实施方式中，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和L858R突变顺反式结构的试剂盒，所述试剂盒包括用于能够同时扩增EGFR基因T790M突变和L858R突变的数字PCR扩增的引物对SEQIDNO：4：CACCTCCACCGTGCAGCT和SEQIDNO：6：CCTCCTTCTGCATGGTATTCT；以及检测检测EGFRT790M突变型探针SEQIDNO：3：ATGAGCTGCATGATGAG，和检测L858R突变探针SEQIDNO：7：AGTTTGGCCCGCCCAA，两探针标记不同的荧光。在一种实施方式中，各个引物在数字PCR扩增体系中的终浓度为200-800nM，各个探针在数字PCR扩增体系中的终浓度为100-600nM。在一种实施方式中，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照是含有待测突变位点的质粒DNA样本与商品化正常人基因组DNA混合后制备：和/或还包括阴性对照，所述阴性对照是商品化正常人基因组片段化DNA。在一种实施方式中，所述试剂盒还包括逆转录试剂，对于两个待检测突变位点距离较远时，使用逆转录试剂获得mRNA，然后对其顺反式结构进行检测。本专利技术的另一个方面是提供一种治疗患者的方法，所述患者的肿瘤细胞可能具有EGFR基因T790M突变与C797突变顺式结构或反式结构，所述方法包括：将患者样本中核酸与本专利技术的引物和探针混合，在合适条件下使模板分子单个分散在液滴中，从而通过检测微液滴荧光信号差异来确定核酸中T790M突变与C797突变是顺式结构还是反式结构。如果确定存在顺式突变，则患者治疗时对第一代和第三代TKI均耐药；如果确定存在反式突变，则患者治疗时可以联合使用第一代和第三代TKI有效。本专利技术的另一个方面是测定使用EGFR抑制剂TKI对患有恶性肿瘤的患者的治疗是否成功的方法，包括：将患者样本中核酸与本专利技术的引物和探针混合，在合适条件下使模板分子单个分散在液滴中，从而通过检测微液滴荧光信号差异来确定核酸中T790M突变与C797突变是顺式结构还是反式结构。如果确定存在顺式突变，则患者治疗时用第一代和第三代TKI可能是不成功的；如果确定存在反式突变，则患者治疗时联合使用第一代和第三代TKI的治疗方案可能是成功的。本专利技术中可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织，也可以是血浆，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。本专利技术方法的优点在于：检测步骤简便、可对DNA或RNA水平的顺反式突变结构进行特异性检测，检测结果灵敏准确，并且可以对发生部分突变的样本进行准确检测。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是检测基因突变顺反式结构的原理图；图2是检测EGFRT790M突变和C797S突变顺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测核酸突变顺反式结构的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤a.根据核酸突变位点设计数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物对能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料；步骤b.对所述核酸位点进行数字PCR扩增和进行扩增后微液滴荧光检测，根据所述微液滴荧光信号差异来确定核酸突变顺反式结构。

【技术特征摘要】
1.一种检测核酸突变顺反式结构的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤a.根据核酸突变位点设计数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物对能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料；步骤b.对所述核酸位点进行数字PCR扩增和进行扩增后微液滴荧光检测，根据所述微液滴荧光信号差异来确定核酸突变顺反式结构。2.权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述核酸是DNA或RNA。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述核酸是RNA时，所述方法还包括将所述RNA逆转录成cDNA的步骤。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和C797S突变顺反式结构的方法。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是检测人表皮生长因子EGFR基因T790M突变和L858R突变顺反式结构的方法。6.一种检测核酸突变顺反式结构的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于扩增包含核酸突变位点的数字PCR扩增引物对和特异性检测探针，所述PCR扩增引物对作为数字PCR扩增的上游引物和下游引物，所述数字PCR扩增引物能够同时扩增待检测的突变位点区域；所述检测探针检测的位置在引物对扩增的区域内，且针对每个检测位点标记不同荧光染料。7.权利要求6中所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸是DNA或RNA。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EG...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝令香，彭志勇，郭永，杨文军，高娜，王勇斗，
申请(专利权)人：新羿制造科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11