薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法技术

本发明专利技术提供了一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，涉及分子标记技术领域。本发明专利技术薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，首先将薄壳山核桃基因组DNA双酶切得到酶切产物，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。通过上述方法建立一套客观、科学、准确的薄壳山核桃DNA甲基化分析技术体系，可以获得银染背景低、目的条带清晰的DNA甲基化图谱，具有可在未知基因组序列的情况下对全基因组甲基化开展研究且甲基化位点易于检测的优点。

Establishment of MSAP Technical System for Carya pecans

The invention provides a method for establishing a thin-shell pecan MSAP technical system, which relates to the technical field of molecular markers. The method for establishing the MSAP technical system of the thin shell Carya nut is that the genomic DNA double enzyme of the hickory nut is first cut into the product of enzyme cleavage, and the obtained product is connected with the primer to obtain the connecting product; then the pre expansion product is amplified by the pre amplification product of the linked product, and the pre expansion product is selected and amplified. Finally, the gel electrophoresis of the selected amplified product is carried out. And silver staining. A set of objective, scientific and accurate DNA methylation analysis system of Carya pecans was established by the above methods. The DNA methylation map with low silver background and clear target bands could be obtained. It has the advantage of being able to study the whole genome methylation without knowing the genome sequence and being easy to detect the methylation sites.

【技术实现步骤摘要】
薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法
本专利技术涉及分子标记
，尤其是涉及一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法。
技术介绍
薄壳山核桃(CaryaillinoensisKoch)，又名美国山核桃或长山核桃，俗称“碧根果”，是胡桃科山核桃属植物，原产美国和墨西哥北部，是世界上著名的干果树种之一。薄壳山核桃其坚果个大、壳薄，出仁率高，取仁容易，产量高，同时果仁色美味香、无涩味、营养丰富，是理想的保健食品或面包、糖果等食品的添加材料。此外，薄壳山核桃亦是重要的木本油料植物，种仁油脂含量高在70％以上，其中不饱和脂肪酸含量高达97％，有很好的贮藏性，是上等的烹调用油和色拉油。薄壳山核桃在我国引种栽培已具有100多年的历史，由于长期存在的不科学的育种及种植方法，我国薄壳山核桃产业存在优良品种缺乏、扩繁技术落后、配套管理技术不完善等问题。因此，对薄壳山核桃的研究越来越得到国家和农林科技人员的重视。目前在薄壳山核桃遗传育种改良方面已经开展了同属不同种间的杂交育种、选择育种和分子标记辅助育种等工作，其中将传统的杂交育种技术同不断发展的生物技术结合来获得优良性状是遗传改良的工作重点。目前虽然已在薄壳山核桃遗传育种改良方面开展了相关工作，但是从DNA甲基化这一表观遗传调控层面出发并应用于分子标记辅助育种方面的研究尚未见报道。DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径之一，能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，进而影响基因表达，是大多数生物体生长发育过程中不可缺少的一部分。甲基化敏感扩增多态性(methylationsensitiveamplificationpolymorphism，MSAP)技术是一种对基因组DNA甲基化进行分析的相对简单且较常用的方法。根据HpaII及MspI这两种酶对基因组中“5’-CCGG-3’”位点中胞嘧啶甲基化状态不同而具有不同的酶切活性，可以酶切产生多态性的DNA片段并最终通过比较PCR扩增产物电泳图谱来分析DNA甲基化状况。因此，建立一套科学准确的薄壳山核桃DNA甲基化分析技术体系，进而在未知基因组序列的情况下对薄壳山核桃全基因组甲基化开展研究，变得十分必要和迫切。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，所述薄壳山核桃MSAP技术体系建立后可以在未知基因组序列的情况下对薄壳山核桃全基因组甲基化开展研究，通过遗传学分子标记的方法，对研究、培育抗病抗逆性强的新薄壳山核桃品种具有非常现实的意义。本专利技术提供的一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，所述方法包括以下步骤：首先将薄壳山核桃基因组DNA双酶切得到酶切产物，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。进一步的，所述将薄壳山核桃基因组DNA双酶切的酶切体系为：400ngDNA、0.3μLEcoRI-HF、0.3μLMspI或0.3μLHpaⅡ、2μLCutsmartBuffer、无菌水补足至20μL。更进一步的，所述酶切分为4～6个时间梯度，每一时间梯度酶切结束后放入65～70℃温浴20min；优选的，所述酶切的温度为35～37℃。进一步的，所述酶切产物与接头引物进行连接的反应体系为：酶切产物20μL、0.1μlT4DNAligase、2.5μlATP、Eadaptor和H/Madaptor均为0.5μL，无菌水补足至25μL；优选的，所述E-adaptor接头引物，其上游引物为：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，下游引物为：5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’；所述H/Madaptor接头引物，其上游引物为：5’-GACGATGAGTCTAGAA-3’，下游引物为：5’-CGTTCTAGACTCATC-3’。进一步的，所述预扩增反应体系为：0.5～2.5μl连接产物，0.1～0.3μlExTaq酶、1～3μldNTP、预扩增引物pre-E和pre-H/M各0.5`2.5μL，2.5μl10×ExTaqBuffer，无菌水补足至25μl。更进一步的，所述预扩增引物pre-E为：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’，预扩增引物pre-H/M为：5’-GATGAGTCTAGAACGGT-3’。进一步的，所述选择扩增反应体系为：稀释0～200倍的预扩增产物0.5～2.5μl,ExTaq酶0.1～0.3μl，0.5～2.5μldNTP选择扩增引物En0.3～2μl，选择扩增引物HMn0.3～2μl，2.5μl10×ExTaqBuffer，无菌水补足至25μl。更进一步的，所述选择扩增引物En序列为：5’-GACTGCGTACCAATTCAXX-3’，所述选择扩增引物HMn序列为：5’-GATGAGTCTAGAACGGTXX-3’，所述引物序列中X代表A，T，C，G四种碱基中的任意一种。进一步的，所述方法还包括对引物进行筛选的步骤。进一步的，所述薄壳山核桃的品种为‘波尼’和‘绍兴’。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，首先将薄壳山核桃基因组DNA双酶切得到酶切产物，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。通过上述方法可为开展薄壳山核桃DNA甲基化遗传机理研究、基因表达的DNA甲基化调控及外界环境变化引起DNA甲基化变化提供分析依据，进而通过建立一套客观、科学、准确的薄壳山核桃DNA甲基化分析技术体系，可以获得银染背景低、目的条带清晰的DNA甲基化图谱，具有可在未知基因组序列的情况下对全基因组甲基化开展研究且甲基化位点易于检测的优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的提取后薄壳山核桃基因组DNA的电泳图；图2为本专利技术实施例2提供的薄壳山核桃基因组DNA用MspI进行双酶切后的电泳图；图3为本专利技术实施例3提供的双酶切产物与接头引物进行连接后的连接产物电泳图；图4为本专利技术实施例4提供的薄壳山核桃预扩增反应后的预扩增产物电泳图；图5为本专利技术实施例5提供的预扩增产物稀释后的凝胶电泳图；图6为本专利技术实施例5提供的薄壳山核桃选择性扩增反应后的选扩产物银染显色图；图7为本专利技术实施例6提供的引物筛选银染显色图；图8为本专利技术实施例6提供的引物对E1-H/M1(E1:5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’,H/M1:5’-GATGAGTCTAGAACGGTAC-3’)选扩增的结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先将薄壳山核桃基因组DNA进行双酶切，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。

【技术特征摘要】
1.一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先将薄壳山核桃基因组DNA进行双酶切，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。2.根据权利要求1所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述将薄壳山核桃基因组DNA双酶切的酶切体系为：400ngDNA、0.3μLEcoRI-HF、0.3μLMspI或0.3μLHpaⅡ、2μLCutsmartBuffer、无菌水补足至20μL。3.根据权利要求2所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述酶切分为4～6个时间梯度，每一时间梯度酶切结束后放入65～70℃温浴20min；优选的，所述酶切的温度为35～37℃，所述酶切的时间为5h。4.根据权利要求1所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述酶切产物与接头引物进行连接的反应体系为：酶切产物20μL、0.1μlT4DNAligase、2.5μlATP、Eadaptor和H/Madaptor均为0.5μL，无菌水补足至25μL；优选的，所述E-adaptor接头引物，其上游引物为：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，下游引物为：5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’；所述H/Madaptor接头引物，其上游引物为：5’-GACGATGAGTCTAGAA-3’，下游引物为：5’-CGTTCTAGACTCATC-3’。5.根据权利要求1所述的薄...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭方仁，刘壮壮，梁有旺，谭鹏鹏，曹凡，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32