本发明专利技术公开了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，具体包括设计检测引物、检测体系的配制、扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。本发明专利技术提供了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，利用大肠杆菌表达系统可以轻易获得高纯度的klenow(exo‑)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo‑)蛋白结合RAA快速扩增技术能大幅度提高对SNP位点的特异性鉴别。
A Method to Improve the Specificity of RAA in SNPs Detection
The invention discloses a method for improving the specificity of RAA technology in SNPs detection, which includes the design and detection of primers, preparation, amplification and agarose gel electrophoresis detection of detection systems. The invention provides a method for improving the specificity of RAA technology in SNPs detection. High purity Klenow (exo) protein can be easily obtained by using E.coli expression system. The target protein is expressed in E.coli system with high expression, simple purification process and low production cost. Combining Klenow (exo) protein with RAA rapid amplification technology can greatly improve the specificity of SNP sites. Identify.
【技术实现步骤摘要】
一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法
本专利技术涉及蛋白质工程
，特别是涉及一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法。
技术介绍
随着测序技术的不断发展人们对于单碱基多态性的重要性有了深入的了解，作为一种遗传变异的分子标记，其对于遗传病研究，药物开发等医药治疗领域及生物学，农学等基础学科都有着广泛的影响。目前关于SNPs的检测技术发展迅速。重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA技术)，是一种利用体内扩增技术实现在核酸体外快速扩增的新型扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。RAA技术能在常温下以较短的时间实现核酸快速扩增，扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光检测实现目的基因的快速检测。Klenow(exo-)是一种中温聚合酶该酶采用突变方式去除了校正核酸酶活性(3’-5’)和(5’-3’)缺口平移酶活性具有链置换活性。因此提供一种将klenow蛋白应用于RAA技术的方法，大幅度提高在SNPs检测中的特异性是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，利用大肠杆菌表达系统可以轻易获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo-)蛋白结合RAA快速扩增技术能大幅度提高对SNP位点的特异性鉴别。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中应用。进一步地，利用klenow(exo-)蛋白作为所述RAA检测体系中的聚合酶，能够有效提高对SNP位点的特异性检测。一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，具体步骤如下：(1)质粒模板为SEQIDNO.12，设计检测引物如下：SalF：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCT；SEQIDNO.1；SalR：GAGCGCTTCCATAATTAATTTCATATTACGCACGG；SEQIDNO.2；SalmF双：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTAG；SEQIDNO.3；SalmF单：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCG；SEQIDNO.4；(2)检测体系的配制50ul扩增反应体系包括50pm上下游引物，5％PEG35K，1ul模板，反应液，加水至50ul；其中，反应液的组分为55mMTris；12mM二硫苏糖醇；12mM磷酸肌酸二钠盐、114ng/uL磷酸肌酶、75mM乙酸钾、490uMdNTPs、3.5mMATP、6％海藻糖、7％甘露醇、5％PEG35000、0.28ug/uL重组酶、0.08ug/uL辅助蛋白、0.3ug/uL单链结合蛋白、0.11ug/uLklenow(exo-)蛋白、105MmKAc和200nMPro-U；(3)扩增在步骤(2)的所述扩增体系中，加入100mmol/L醋酸镁激活反应，并在37℃条件下，反应30min后，再加入50ul体积比为1:1的酚-氯仿溶液结束反应；(4)琼脂糖凝胶电泳检测将步骤(3)中扩增结束后的反应液进行离心，其中最上层上清为扩增产物，将所述扩增后产物以1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。进一步地，步骤(4所述离心方法为：12000rpm，离心5min。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，具有如下技术优点：本专利技术提供了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，利用大肠杆菌表达系统可以轻易获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo-)蛋白结合RAA快速扩增技术能大幅度提高对SNP位点的特异性鉴别。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术提供的pTrc99a-klenow(exo-)质粒构建示意图；图2附图为本专利技术提供的PCR法获取的突变位点；其中泳道1-4为PCR片段1；泳道5-8为PCR片段2；泳道M为2000bp核酸Marker；图3附图为本专利技术提供的overlapPCR获得目的片段；其中泳道1-7为overlapPCR结果；泳道M为2000bp核酸Marker；图4附图为本专利技术提供的重组质粒的双酶切鉴定；其中泳道1为重组质粒双酶切后的；泳道2为重组质粒双酶切前；泳道M为2000bp核酸Marker；图5附图为本专利技术提供的工程菌株诱导表达检测；其中泳道1为未诱导对照沉淀；泳道2为未诱导对照上清；泳道3为诱导1号菌沉淀；泳道4为诱导2号菌上清；泳道5为诱导2号菌沉淀；泳道6为诱导1号菌上清；泳道M为蛋白Marker；图6附图为本专利技术提供的目的蛋白镍柱纯化；其中泳道1为破碎后沉淀；泳道2为流穿；泳道3为20mM咪唑洗脱；泳道4为40mM咪唑洗脱；泳道5为100mM咪唑洗脱；泳道6为500mM咪唑洗脱；泳道M为为蛋白Marker；图7附图为本专利技术提供的目的蛋白肝素柱纯化；其中泳道1-4为Heparine柱线性洗脱目的蛋白；图8附图为本专利技术提供的引物3端双碱基突变后扩增结果；其中泳道1-2为模板10ng/ul、引物SalF和引物SalR；泳道3-4为模板1ng/ul、引物SalF和引物SalR；泳道5-6为模板100pg/ul、引物SalF和引物SalR；泳道7-8为模板10pg/ul、引物SalF和引物SalR；泳道9-10为模板10ng/ul、引物SalmF单和引物SalR；泳道11-12为模板1ng/ul、引物SalF单和引物SalR；泳道13-14为模板100pg/ul、引物SalmF单和引物SalR；泳道15-16为模板0.1fg/ul、引物SalF单和引物SalR；泳道M为2000Bbp核酸Marker；图9附图为本专利技术提供的引物3端双碱基突变后扩增结果；泳道1-2为模板10ng/ul、引物SalmF双和引物SalR；泳道3-4为模板10ng/ul、引物SalF和引物SalR；泳道5-6为模板100pg/ul、引物SalmF双和引物SalR；泳道7-8为模板100pg/ul、引物SalF和引物SalR；泳道9-10为模板100fg/ul、引物SalmF双和引物SalR；泳道11-12为模板100fg/ul、引物SalF和引物SalR；泳道13为模板0.1fg/ul、引物SalmF双和引物SalR；泳道14为模板0.1fg/ul、引物SalF和引物SalR；泳道M为2000Bbp核酸Marker。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.klenow(exo‑)蛋白在RAA检测体系中应用。
【技术特征摘要】
1.klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中应用。2.根据权利要求1所述的klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中应用，其特征在于，利用klenow(exo-)蛋白作为所述RAA检测体系中的聚合酶，能够有效提高对SNP位点的特异性检测。3.一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)质粒模板为SEQIDNO.12，设计检测引物如下：SalF：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCT；SEQIDNO.1；SalR：GAGCGCTTCCATAATTAATTTCATATTACGCACGG；SEQIDNO.2；SalmF双：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTAG；SEQIDNO.3；SalmF单：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCG；SEQIDNO.4；(2)检测体系的配制50ul扩增反应体系包括50pm上下游引物，5％PEG35K，1u...
【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，孙文丽，
申请(专利权)人：浙江善测禾骑士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。