一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，具体包括获得突变的LPOR‑Y193F cDNA序列、表达载体构建、LPOR‑Y193F突变体蛋白表达、LPOR‑Y193F突变体蛋白分离、LPOR‑Y193F突变体蛋白纯化和LPOR‑Y193F突变体蛋白结晶。本发明专利技术提供了一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，从而对LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的结构进行解析，为LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

Preparation of a LPOR-Y193F Mutant Protein Crystal

The invention discloses a preparation method of LPOR Y193F mutant protein crystal, which includes obtaining mutant LPOR Y193F gene sequence, construction of expression vector, expression of LPOR Y193F mutant protein, separation of LPOR Y193F mutant protein, purification of LPOR Y193F mutant protein and crystallization of LPOR Y193F mutant protein. The invention provides a preparation method of LPOR Y193F mutant protein crystals, thereby analyzing the structure of LPOR Y193F mutant protein crystals, laying a foundation for the structure analysis and phase determination of LPOR protein, and laying a foundation for thoroughly clarifying and determining the catalytic mechanism of photosensitive superprotein or its engineering.

【技术实现步骤摘要】
一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法
本专利技术涉及蛋白质工程
，特别是涉及一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法。
技术介绍
LPORs是可溶性的单体蛋白，约300个氨基酸，从SDR家族总科的一个分支进化而来。LPOR蛋白与SDR家族共同的特征是光依赖性。类似于另一种已知的光酶DNA光解酶，它含有两个色团：FAD和MDHF/8-HDF，所有的LPORs蛋白都含有NADPH作为辅因子，并有一个Tyr-依赖的催化部位，同时，它的底物Pchlide本身作为光的天线或另一个共因子。整体LPORs结晶的结构，非常类似于一个未知SDR-like蛋白质序列，29.89％的同源性，3rd5来自于partuberculosis分枝杆菌，这也使得LPORs晶体成为了迄今最好的建模模板。然而，获得LPOR蛋白x射线晶体结构，解决相位问题，仍然需要重金属衍生品。因此，对LPOR-Y193F突变体蛋白的晶体结构分析，从而对LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得突变的LPOR‑Y193F cDNA序列设计LPOR cDNA Y193F突变引物，利用KOD Plus mutagenesis kit获得突变的LPOR‑Y193F cDNA序列为SEQ ID NO 1；其中LPOR cDNA Y193F突变引物为Y193FN 5’‑GCAAGGCCTTCAAAGACAGCATGCTCAGCAATATGCTG‑3’；SEQ IDNO 2；Y193FC 5’‑GTCTTTGGCGGCCTTGCCCGACTTGAAGGGCTTACCG‑3’；SEQ IDNO 3；(2)表达...

【技术特征摘要】
1.一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得突变的LPOR-Y193FcDNA序列设计LPORcDNAY193F突变引物，利用KODPlusmutagenesiskit获得突变的LPOR-Y193FcDNA序列为SEQIDNO1；其中LPORcDNAY193F突变引物为Y193FN5’-GCAAGGCCTTCAAAGACAGCATGCTCAGCAATATGCTG-3’；SEQIDNO2；Y193FC5’-GTCTTTGGCGGCCTTGCCCGACTTGAAGGGCTTACCG-3’；SEQIDNO3；(2)表达载体构建将得到的所述LPOR-Y193FcDNA克隆到原核表达载体pE-SUMO3中，得到pE-SUMO3-LPOR-Y193F；(3)LPOR-Y193F突变体蛋白表达将所述pE-SUMO3-LPOR-Y193F转入大肠杆菌BL21细胞中，并于25-37℃，培养3-5小时，直到OD600达到0.8，加入诱导剂于25-30℃，培养3-6小时，得到菌体悬液；(4)LPOR-Y193F突变体蛋白分离将步骤3得到的所述菌体悬液进行离心并弃上清液，将得到的菌体重悬于冰浴的溶液A中，得到悬浊液；将所述悬浊液进行均质后离心，得悬浊液上清液，并将所述悬浊液上清液经0.44um的滤膜过滤后，上样5-mlHiTrapFF原油柱，利用溶液B按咪唑浓度梯度洗脱；(5)LPOR-Y193F突变体蛋白纯化收集步骤(4)洗脱下来的蛋白峰，加入SENP2蛋白酶，切掉SUMO尾巴，然后利用溶液C进行透析；随后，蛋白上样5-mlHitrapQHP柱，洗脱溶液为0.05–0.5MNaCl梯度洗脱液；回收蛋白峰，过Superdex75分子筛柱子，得到LPOR-Y193F突变体蛋白；(6)LPOR-Y193F突变体蛋白结晶将(5)得到的所述LPOR-Y193F突变体蛋白浓缩至26-30mg/ml，随后浓缩蛋白在蛋白点晶池液中生长1周；挑取晶体在防冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，孙文丽，
申请(专利权)人：浙江善测禾骑士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33