一种基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，该方法利用基因工程技术构建的含天花粉突变体的基因的大肠杆菌，经过一定规模的发酵培养和简洁有效的分离提纯工艺直接得到，具体包括以下步骤：重组天花粉蛋白突变体质粒转化、大肠杆菌发酵、天花蛋白突变体分离提取，该工艺可作为规模化生产工艺。经过发酵纯化的天花粉蛋白突变体，与天然天花粉蛋白相比，生物活性基本不变，得到的蛋白不仅毒性和过敏原性降低，而且也解决了药物制备的原料问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，实现了在采用发酵工艺生产重组天花粉蛋白突变体的药物。
技术介绍
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是来源于中药天花粉，是从葫芦科植物栝楼根中抽提取的一个植物蛋白，它的化学本质为一种单链的核糖体失活蛋白，能特异切除真核细胞28S rRNA上第4324位腺嘌呤，从而阻断蛋白质的合成。TCS可以作为新一代的抗艾滋病良药，不仅疗效确切，而且耐受性较好。近十年来，TCS在基础研究和应用研究方面都有了很大进展。1989年，McGrath和杨显荣等在美国科学院报上发表关于TCS抗HIV的研究报告，美国食品及药品监督管理局(FDA)批准TCS进行分子定点改造，目的在于保留TCS药效活性的同时降低其毒副作用，使之临床应用更加安全。TCS临床应用时偶尔会引起过敏反应，极大的限制了它的应用。重组DNA技术为TCS的改造和大规模生产提供了崭新的途径。基因重组天花粉蛋白突变体(MTCS)是从基层水平对TCS的局部进行定点改造后获得的，既能保留TCS的原有功能，又能解决其毒副作用，目前国内由北京翔天牧生物科技有限公司申请的涉及天花粉蛋白突变体的三项专利技术专利均已授权，专利号分别为：ZL01103102.6、ZL01816701.2和ZL200410042402.4。目前国内不少高表达的基因工程产品是以包涵体形式被表达出来，这是由于产品在表达的宿主菌种未能正确构象造成。虽然包涵体有得率高、便于初步纯化的优点，但要使其复性，需要经过变性复性的过程，在这个过程中使用的变性剂和复性剂很难去除完全，而国际上对基因工程产品不含变性剂的要求却是非常严格；通常以可溶性的方式被表达出来的基因工程产品，得率一般不高。本专利技术在以往专利的基础上，在对菌体的生产环境和MTCS表达条件进行深入研究后确定的工程菌发酵工艺，可以保证MTCS工程菌得以高水平表达，并且产品是以可溶方式被表达出来，整个生产过程不含任何变性剂和复性剂，符合国际上对基因工程产品的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，该发酵工艺及纯化方法，不仅可以高效表达出MTCS，而且在整个纯化过程中，不加入任何的变性剂和复性剂，是一种高表达可溶性MTCS的发酵工艺和简便纯化MTCS的方法，通过该方法，不仅可以生产出低毒副作用的MTCS，而且也为MTCS的生产解决了原料问题。本专利技术的具体技术方案如下：1.一种基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，该方法的详细生产工艺如下：含MTCS基因的质粒载体→转化宿主得工程菌→工程菌接种培养→放大发酵培养→MTCS基因的诱导表达→离心收集菌体→菌体的超声波破碎→上清液过柱得粗产品→透析→产品。2.根据上述1所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，其中，所使用的宿主菌株为大肠杆菌BL21菌株。3.根据上述1所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，其中，发酵所用培养基为改良的M9ZB培养基，配方如下：4.根据上述3所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵培养基，其中，发酵过程中所加入的补料为葡萄糖、蛋白胨和氨水，如下所示：5.根据上述1所述的基因重组天花粉蛋白突变体分离提纯步骤方法，其中，所用填料为CM-Sepharse-CL-6B离子交换柱。6.根据上述1所述的基因重组天花粉蛋白突变体分离提纯步骤方法，其中，所使用的透析液为50％的医用甘油。7.根据上述1所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，其中，所透析后的蛋白要再进行去热源处理。8.根据上述7所述的产品去热源处理，其中，所使用的方法为使用活性炭进行处理。具体实施方式下面用实施例来进一步详述本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例一：MTCS发酵流程1.将MTCS质粒转化到BL21感受态中；2.将转化好的BL21在200mlLB液体培养基中进行培养，35℃、200rpm振荡培养15小时，制备种子液；3.按照以下配方进行培养基配制发酵培养基补料4.110℃，15分钟，将培养基和补料进行蒸汽灭菌。5.将长至0.25OD左右的种子液接种到发酵罐中进行发酵。6.当OD约为12左右时，加入1mM IPTG进行诱导表达。7.诱导表达4个小时后，收集发酵液。8.离心收集菌体。最终离心后，得到的湿菌体重量为55g湿菌体/L发酵液。实施例二：MTCS纯化流程1.破碎菌体取55g湿菌体，加入400ml的50m mol Tris-HCl pH7.4细胞裂解液，放入到超声波破碎仪中，在0℃冰浴条件下，间隔20秒破碎20秒，直到菌体全部破碎。2.离心在4℃下，16950g离心30min，收集上清液。3.上柱先用注射水预平衡CM-Sepharse-CL-6B离子交换柱，平衡完成后，将样品瓶置于高于离子交换柱依靠重力缓慢上样。上样完成后，用约5个柱体积去热源的50m molTris-HCl pH7.4平衡液平衡柱。4.洗脱用200mM NaCl，50m mol Tris-HCl pH7.4洗脱液洗脱样品，用紫外监测器监测280的吸收值，并收集目的样品峰。5.透析用去热源的50m mol Tris-HCl pH7.4缓冲液进行透析。6.再次离心在4℃下，16950g离心30min，收集上清液。7.上柱先用注射水预平衡CM-Sepharse-CL-6B离子交换柱，平衡完成后，将样品瓶置于高于离子交换柱依靠重力缓慢上样。上样完成后，用约10个柱体积去热源的50m molTris-HCl pH7.4平衡液平衡柱。8.梯度洗脱将0-0.3mol NaCl，50m mol Tris-HCl pH7.4洗脱液梯度洗脱样品。9.透析用50％的医用甘油为缓冲液进行透析，共透析2遍。10.去热源将待用的活性炭200℃、2h干热灭菌，在超净台内将透析后的蛋白通过活性炭吸附柱进行去热源处理。最终得到蛋白108mg，得率为108mg/L。以上实施例说明使用本专利技术的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法能保证MTCS工程菌得以高水平表达，并且产品是以可溶方式被表达出来，整个生产过程不含任何变性剂和复性剂，符合国际上对基因工程产品的要求。同时对所得到产品可以有效的去热源，是一种高表达可溶性MTCS的发酵工艺和简便纯化MTCS的方法，通过该方法，不仅可以生产出低毒副作用的MTCS，而且也为MTCS的生产解决了原料问题。以上所述仅为本专利技术的较佳实施范例，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，该方法包括重组天花粉蛋白突变体质粒转化、菌株发酵、天花蛋白突变体分离提取。

【技术特征摘要】
1.一种基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，该方法包括重组天花粉蛋白突变体质粒转化、菌株发酵、天花蛋白突变体分离提取。2.根据权利要求1所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，其特征在于，所使用的宿主菌株为大肠杆菌BL21菌株。3.根据权利要求1所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方法，其特征在于，发酵所用培养基为改良的M9ZB培养基，配方如下4.根据权利要求3所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵培养基，其特征在于，发酵过程中所加入的补料为葡萄糖、蛋白胨和氨水，其配方如下：5.根据权利要求1所述的基因重组天花粉蛋白突变体的发酵工艺及纯化制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭利川，刘思哲，刘小曼，程奇，王智宏，
申请(专利权)人：无锡翔天奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32