一种Klenow（exo-）突变蛋白的表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种Klenow(exo‑)突变蛋白的表达纯化方法，具体步骤如下：扩增Klenow(exo‑)目的片段；构建重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)；重组表达质粒的诱导表达；Klenow(exo‑)蛋白的初步纯化；Klenow(exo‑)蛋白的进一步纯化。本发明专利技术公开提供了一种大规模制备klenow(exo‑)蛋白的方法，通过overlap获得klenow(exo‑)基因并引入组氨酸标签，利用大肠杆菌表达系统获得高纯度的klenow(exo‑)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低。

A method for expression and purification of Klenow (exo-) mutant protein

The present invention discloses a method for expression and purification of Klenow (exo) mutant protein. The specific steps are as follows: amplifying the target fragment of Klenow (exo); constructing the recombinant expression plasmid pTrc99a Klenow (exo); inducing expression of the recombinant expression plasmid; preliminary purification of Klenow (exo) protein; and further purification of Klenow (exo) protein. The invention discloses a method for large-scale preparation of Klenow (exo) protein. The Klenow (exo) gene is obtained by overlap and the histidine label is introduced. The high purity Klenow (exo) protein is obtained by using the E. coli expression system. The target protein is expressed in the E. coli system with high quantity, simple purification process and low production cost.

【技术实现步骤摘要】
一种Klenow(exo-)突变蛋白的表达纯化方法
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种Klenow(exo-)突变蛋白的表达纯化方法。
技术介绍
Klenow(exo-)是一种中温聚合酶，该酶采用突变方式去除了校正核酸酶活性(3’-5’)和(5’-3’)缺口平移酶活性，具有链置换活性，因此具有较高的特异性。然而Klenow(exo-)酶售价昂贵，如果直接购买应用于检测时会导致最终产品的试剂盒成本及价格较高，不利于其大规模商业化应用。因此，提供一种大规模制备klenow(exo-)蛋白的方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种大规模制备klenow(exo-)蛋白的方法，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种Klenow(exo-)突变蛋白的表达纯化方法，具体步骤如下：(1)扩增Klenow(exo-)目的片段①以大肠杆菌BL21基因组为模板，分别用引物F1、R1和F2、R2进行PCR扩增，获得片段1和片段2，进行胶回收；②以等比例混合的回收的片段1和片段2为模板，F2和R1为引物，进行Over-lapPCR，获得Klenow(exo-)目的片段，进行胶回收；所述引物序列如下：F1：5’-AAGCGCCGGTATTTGCATTTGCTACCGCAACCGACAGCCTTGATAACAT-3’；SEQIDNO：4；R1：5’-CCCAAGCTTTTAGTGCGCCTGATCCCAGTTTTCG-3’；HindIII；SEQIDNO：5；F2：5’-CATGCCATGGATCATCATCACCATCACCACATGATTTCTTATGACAACTACGTCACCA-3’；NcoI；SEQIDNO：6；R2：5’-AAATGCAAATACCGGCGCTTTTTCCAG-3’；SEQIDNO：7；(2)构建重组表达质粒pTrc99a-klenow(exo-)分别对pTrc99a质粒和Klenow(exo-)目的片段进行双酶切，以2：1的比例进行连接反应；连接产物转化大肠杆菌克隆菌株，获得阳性克隆，提质粒，获得重组表达质粒pTrc99a-klenow(exo-)；(3)重组表达质粒的诱导表达将重组表达质粒pTrc99a-klenow(exo-)转化大肠杆菌表达菌株，利用IPTG诱导，收集菌体，超声破碎，进行SDS-PAGE，获得Klenow(exo-)蛋白；(4)Klenow(exo-)蛋白的初步纯化收集经IPTG诱导的菌体，用破碎缓冲液重悬菌体，进行均质破碎，收集液体，用镍柱做亲和层析，完成Klenow(exo-)蛋白的初步纯化；(5)Klenow(exo-)蛋白的进一步纯化通过预装柱HeparineHP，除去部分Klenow(exo-)蛋白中残留的核酸，并完成Klenow(exo-)蛋白的进一步纯化。优选地，步骤(2)所述连接反应的反应条件为：25℃连接3h。优选地，步骤(3)所述大肠杆菌表达菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株。优选地，步骤(3)所述利用IPTG诱导为：加入终浓度为0.5mmol/LIPTG于37℃诱导4h。优选地，步骤(4)所述破碎缓冲液为30mMpH7.4的PB，20mM咪唑，500mM氯化钠。优选地，步骤(4)所述用镍柱做亲和层析，咪唑的浓度为0、20、40、100和500mM。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种大规模制备klenow(exo-)蛋白的方法，通过overlap获得klenow(exo-)基因并引入组氨酸标签，利用大肠杆菌表达系统获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术pTrc99a-klenow(exo-)质粒构建示意图；图2附图为本专利技术PCR法获取突变位点；其中，1-4：PCR片段1；5-8：PCR片段2；M：2000bp核酸Marker；图3附图为本专利技术overlapPCR获得目的片段；其中，1-7：overlapPCR结果；M：2000bp核酸Marker；图4附图为本专利技术重组质粒的双酶切鉴定；其中，1：重组质粒双酶切后；2：重组质粒双酶切前；M：2000bp核酸Marker；图5附图为本专利技术工程菌株诱导表达检测图；其中，1：未诱导对照沉淀；2：未诱导对照上清；3：诱导1号菌沉淀；4：诱导2号菌上清；5：诱导2号菌沉淀；6：诱导1号菌上清；M：蛋白Marker；图6附图为本专利技术目的蛋白镍柱纯化图；其中，1：破碎后沉淀；2：0mM咪唑洗脱；3：20mM咪唑洗脱；4：40mM咪唑洗脱；5：100mM咪唑洗脱；6：500mM咪唑洗脱；M：蛋白Marker；图7附图为本专利技术目的蛋白肝素柱纯化图；其中，1-4：Heparine柱线性洗脱目的蛋白。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1目的片段的扩增以大肠杆菌BL21基因组为模板，分别用引物F1，R1和F2，R2进行PCR扩增，扩增后分别获得片段1和片段2(片段1为klenow(exo-)蛋白酶I，片段2为包含两个氨基酸突变的一小段序列)，进行胶回收。通过PCR方式引入突变位点，设计引物时使两个片段带有20bp左右的同源重组区域，PCR扩增获得大小分别为1725bp的片段1(SEQIDNO：1)，和132bp的片段2(SEQIDNO：2)，结果见图2。片段1扩增参数为94℃5min；94℃40s，57℃40s，72℃2min，共32个循环；72℃10min。片段2扩增参数为94℃5min；94℃40s，57℃40s，72℃30s，共32个循环；72℃10min。然后以回收的片段1和片段2等比例混合为模板，以F2和R1为上下游引物进行Over-lapPCR，获得大小约2000bp的klenow(exo-)目的片段(SEQIDNO：3)，结果见图3。反应体系均为25ul，反应后产物以1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电泳后以胶回收试剂盒回收klenow(exo-)目的片段PCR产物。Over-lapPCR扩增参数为94℃5min；94℃40s，54℃40s，72℃2min，共32个循环；72℃10min。其中，引物序列如下：F1：5’-AAGCGCCGGTATTTGCATTTGCTACCGCAACCGACAGCCTTGATAACAT-3’；SEQIDNO：4；R1：5’-CCCAAGCTTTTAGTGCGCCTGATCCCAGTTTTCG-3’；HindIII；SEQIDNO：5；F2：5’-CAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Klenow(exo‑)突变蛋白的表达纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)扩增Klenow(exo‑)目的片段①以大肠杆菌BL21基因组为模板，分别用引物F1、R1和F2、R2进行PCR扩增，获得片段1和片段2，进行胶回收；②以等比例混合的回收的片段1和片段2为模板，F2和R1为引物，进行Over‑lapPCR，获得Klenow(exo‑)目的片段，进行胶回收；所述引物序列如下：F1：5’‑AAGCGCCGGTATTTGCATTTGCTACCGCAACCGACAGCCTTGATAACAT‑3’；SEQ ID NO：4；R1：5’‑CCCAAGCTTTTAGTGCGCCTGATCCCAGTTTTCG‑3’；HindIII；SEQ ID NO：5；F2：5’‑CATGCCATGGATCATCATCACCATCACCACATGATTTCTTATGACAACTACGTCACCA‑3’；NcoI；SEQ ID NO：6；R2：5’‑AAATGCAAATACCGGCGCTTTTTCCAG‑3’；SEQ ID NO：7；(2)构建重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)分别对pTrc99a质粒和Klenow(exo‑)目的片段进行双酶切，以2：1的比例进行连接反应；连接产物转化大肠杆菌克隆菌株，获得阳性克隆，提质粒，获得重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)；(3)重组表达质粒的诱导表达将重组表达质粒pTrc99a‑klenow(exo‑)转化大肠杆菌表达菌株，利用IPTG诱导，收集菌体，超声破碎，进行SDS‑PAGE，获得Klenow(exo‑)蛋白；(4)Klenow(exo‑)蛋白的初步纯化收集经IPTG诱导的菌体，用破碎缓冲液重悬菌体，进行均质破碎，收集液体，用镍柱做亲和层析，完成Klenow(exo‑)蛋白的初步纯化；(5)Klenow(exo‑)蛋白的进一步纯化通过预装柱HeparineHP，除去部分Klenow(exo‑)蛋白中残留的核酸，并完成Klenow(exo‑)蛋白的进一步纯化。...

【技术特征摘要】
1.一种Klenow(exo-)突变蛋白的表达纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)扩增Klenow(exo-)目的片段①以大肠杆菌BL21基因组为模板，分别用引物F1、R1和F2、R2进行PCR扩增，获得片段1和片段2，进行胶回收；②以等比例混合的回收的片段1和片段2为模板，F2和R1为引物，进行Over-lapPCR，获得Klenow(exo-)目的片段，进行胶回收；所述引物序列如下：F1：5’-AAGCGCCGGTATTTGCATTTGCTACCGCAACCGACAGCCTTGATAACAT-3’；SEQIDNO：4；R1：5’-CCCAAGCTTTTAGTGCGCCTGATCCCAGTTTTCG-3’；HindIII；SEQIDNO：5；F2：5’-CATGCCATGGATCATCATCACCATCACCACATGATTTCTTATGACAACTACGTCACCA-3’；NcoI；SEQIDNO：6；R2：5’-AAATGCAAATACCGGCGCTTTTTCCAG-3’；SEQIDNO：7；(2)构建重组表达质粒pTrc99a-klenow(exo-)分别对pTrc99a质粒和Klenow(exo-)目的片段进行双酶切，以2：1的比例进行连接反应；连接产物转化大肠杆菌克隆菌株，获得阳性克隆，提质粒，获得重组表达质粒pTrc99a-klenow(exo-)；(3)重组表达质粒的诱导表达将重组表达质粒pTrc99a-klenow(exo-)转化大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，孙文丽，
申请(专利权)人：浙江善测禾骑士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33