一种LPOR蛋白的表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种LPOR蛋白的表达纯化方法，具体包括LPOR蛋白的表达方法和LPOR蛋白的纯化方法，其中LPOR蛋白的表达方法包括：筛选LPOR基因的DNA序列、DNA序列的扩增、双酶切、LPOR表达载体构建、LPOR表达载体的筛选和LPOR蛋白表达；其中LPOR蛋白的纯化方法包括：His‑tag亲和层析、蛋白浓缩和凝胶过滤。本发明专利技术提供了一种LPOR蛋白的表达纯化方法，使得LPOR蛋白具有较高的活性，为其他光敏感超速蛋白的表达纯化提供实验技术，为光敏感超速蛋白的结构解析奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

A Method of Expression and Purification of LPOR Protein

The present invention discloses an expression and purification method of LPOR protein, including the expression method of LPOR protein and the purification method of LPOR protein. The expression method of LPOR protein includes: screening DNA sequence of LPOR gene, amplification of DNA sequence, double digestion, construction of LPOR expression vector, screening of LPOR expression vector and expression of LPOR protein. The purification method of LPOR protein includes: His_t. AG affinity chromatography, protein concentration and gel filtration. The invention provides a method for expression and purification of LPOR protein, which makes LPOR protein have high activity, provides experimental technology for expression and purification of other light-sensitive super-speed proteins, lays a foundation for structure analysis of light-sensitive super-speed proteins, and lays a foundation for thoroughly clarifying and determining the catalytic mechanism of light-sensitive super-speed proteins or for their engineering.

【技术实现步骤摘要】
一种LPOR蛋白的表达纯化方法
本专利技术涉及蛋白质工程
，特别是涉及一种LPOR蛋白的表达纯化方法。
技术介绍
LPOR(light-dependentprotochlorophyllideoxidoreductase)是蓝细菌、藻类和多细胞植物叶绿素合成的关键酶。在光合作用途径中，生物体催化原叶绿素酸酯Pchlide还原有2种不同的还原酶：一种是依赖光的LPOR(light-dependentNADPH:protochlorophyllideoxidoreductase)；另一种是不依赖光的Pchlide氧化还原酶DPOR(light-independentPchlidereductase)。LPOR或DPOR作为原叶绿素酸脂还原催化酶，是光合营养生物中叶绿素合成的关键酶，这两个酶均广泛存在于光营养生物中，但是，DPOR与LPOR在分子结构、亚基组成、基因组编码和催化反应机制等方面完全不一样。DPOR是由叶绿体基因组编码，由3个蛋白质亚基组成；LPOR是由细胞核基因组编码；其中DPOR和LPOR的功能相似，均能够催化PchlideD环双键的还原。其中，无氧光合细菌只有DPOR；裸子植物、藻类、蓝细菌和光合细菌具有DPOR和LPOR；被子植物只有LPOR。在近十年里，LPOR的调控、功能和催化机制等方面的研究取得了较大的进展，但是由于一直没有揭开LPOR三维结构的神秘面纱，对彻底阐明和确定LPOR的催化机理或将其工程化构成了一种无法逾越的屏障，多年来，科学家们试图用电脑模拟的手段来为生化学家提供线索，然而这些都只是推测，而对LPOR蛋白结构解析的难点，则是LPOR蛋白的纯化和结晶过程。蛋白质提纯技术应用广泛，以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，而研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面：一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。虽然蛋白质的纯化技术已经非常成熟，但是对于一些极度不稳定的光敏蛋白，还是目前蛋白提纯研究的难点。因此，提供一种LPOR蛋白的表达纯化方法，使得LPOR蛋白具有较高的活性是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了提供一种LPOR蛋白的表达纯化方法，使得LPOR蛋白具有较高的活性，为其他光敏感超速蛋白的表达纯化提供实验技术，为光敏感超速蛋白的结构解析奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种LPOR蛋白的表达方法，包括以下步骤：(1)筛选LPOR基因的DNA序列根据genebank中公布的LPOR蛋白的核苷酸序列NC_004113设计引物，并在所述引物两端加入BspHI/BamHI酶切位点，从所述NC_004113序列中筛选LPOR基因的DNA序列为SEQIDNO3，并选择原核表达载体；其中所述引物序列为LPORN：5’-TCATGAATGAGTGATCAGCCACG-3’；SEQIDNO1；LPORC：5’-GGATCCGGCCAATCCCACCAGTTTTTC-3’；SEQIDNO2；(2)将步骤(1)得到的LPOR基因的所述DNA序列进行PCR扩增；(3)双酶切将步骤(2)得到的PCR产物纯化后分别用BspHI/BamHI双酶切，同时将所述原核表达载体用BspHI/BamHI双酶切，回收酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段；(4)LPOR表达载体构建将步骤(3)得到酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段，按10:1-5:5的比例混合连接，并将得到的连接产物转入感受态细胞中，得到LPOR表达载体；(5)LPOR表达载体的筛选将步骤(4)得到的所述LPOR表达载体挑取在筛选平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，提取质粒，酶切验证正确后测序确认；将测序结果正确的LPOR表达载体保存备用。(6)LPOR蛋白表达将步骤(5)中构建好的LPOR表达载体转入原核表达菌株中，在25-37℃下培养24-48h，加入诱导剂表达LPOR蛋白。其中，本专利技术步骤(2)中PCR扩增条件为：95℃4min，经95℃40sec、55℃30sec、72℃1min循环扩增25次。其中，本专利技术步骤(6)中根据LPOR蛋白的表达进行pull-down检测结果，表达量多且小量pull-down结果杂带较少，可用于LPOR蛋白的纯化。进一步地，步骤(1)中所述原核表达载体为pEHISTEV、pBADHISTEV1、pEBMSCHIS或pEBSRCTEVC10HIS中的一种。进一步地，步骤(4)中所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。进一步地，步骤(5)中所述筛选平板培养基为含有50-150mg/L的卡那霉素或氨苄霉素抗性的培养基。进一步地，步骤(6)中所述原核表达菌株为大肠杆菌C43、大肠杆菌BL21或194菌株。进一步地，步骤(6)中所述诱导剂为0.1-1.0mM的IPTG或质量浓度为0.01-0.05％的L-Arabinose。一种LPOR蛋白的纯化方法，包括以下步骤：(1)His-tag亲和层析将权利要要求1步骤(6)中经过诱导剂诱导的菌液离心，收集菌体细胞并利用清洗液清洗，再用平衡液漂洗，最后用35mL/g的平衡液重悬，将收集好的菌液超声破碎，离心后取上清液，后真空过滤，再进行His-tag亲和层析；(2)蛋白浓缩将步骤(1)得到的蛋白加入超滤杯中，3000-5000rpm，离心，直至达到所需体积后停止离心，并测定蛋白浓度；(3)凝胶过滤将步骤(2)得到的浓缩蛋白加入0.5uMNADPH辅酶后进行凝胶过滤层析，收集蛋白样品，将所述蛋白样品进行sds-page分析，得到单一目标条带的蛋白样品，再利用所述超滤杯浓缩蛋白样品至浓度为10-15mg/ml。优选的，步骤(1)菌液离心方法为3000-5000rpm，20min。优选的，步骤(1)清洗液为0.1mM的PBS液体。优选的，步骤(1)菌液超声破碎方法为功率200W，1/2探头，破碎30s，间歇30S。优选的，步骤(1)菌液超声破碎后的离心方法为16000-19000rpm，离心20min。优选的，His-tag亲和层析纯化方法，包括平衡、上样、洗涤、洗脱和保存，其具体操作方法为：平衡：用平衡液(上样缓冲液)平衡预装柱，打开紫外检测仪，调节波长至280nm，灵敏度为100％，预热，使液体匀速向下流(3mL/min)，此时，调节光量，使吸光值保持100稳定，此时为调满，待吸光值稳定后，调节灵敏度为0.5A/0.2A，使吸光值保持0稳定，此时为调基线。上样：将提前处理好的样品缓慢加入柱内，避免气泡的产生，保持尽量较低的流速(1mL/min)，待吸光值大于20时，用50ml离心管接流出的蛋白溶液，称流穿，流穿内的蛋白应为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)筛选LPOR基因的DNA序列根据genebank中公布的LPOR蛋白的核苷酸序列NC_004113设计引物，并在所述引物两端加入BspHI/BamHI酶切位点，从所述NC_004113序列中筛选LPOR基因的DNA序列为SEQ ID NO 3，并选择原核表达载体；其中所述引物序列为LPORN：5’‑TCATGAATGAGTGATCAGCCACG‑3’；SEQ ID NO 1；LPORC：5’‑GGATCCGGCCAATCCCACCAGTTTTTC‑3’；SEQ ID NO 2；(2)将步骤(1)得到的LPOR基因的所述DNA序列进行PCR扩增；(3)双酶切将步骤(2)得到的PCR产物纯化后分别用BspHI/BamHI双酶切，同时将所述原核表达载体用BspHI/BamHI双酶切，回收酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段；(4)LPOR表达载体构建将步骤(3)得到酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段，按10:1‑5:5的比例混合连接，并将得到的连接产物转入感受态细胞中，得到LPOR表达载体；(5)LPOR表达载体的筛选将步骤(4)得到的所述LPOR表达载体挑取在筛选平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，提取质粒，酶切验证正确后测序确认；将测序结果正确的LPOR表达载体保存备用。(6)LPOR蛋白表达将步骤(5)中构建好的LPOR表达载体转入原核表达菌株中，在25‑37℃下培养24‑48h，加入诱导剂表达LPOR蛋白。...

【技术特征摘要】
1.一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)筛选LPOR基因的DNA序列根据genebank中公布的LPOR蛋白的核苷酸序列NC_004113设计引物，并在所述引物两端加入BspHI/BamHI酶切位点，从所述NC_004113序列中筛选LPOR基因的DNA序列为SEQIDNO3，并选择原核表达载体；其中所述引物序列为LPORN：5’-TCATGAATGAGTGATCAGCCACG-3’；SEQIDNO1；LPORC：5’-GGATCCGGCCAATCCCACCAGTTTTTC-3’；SEQIDNO2；(2)将步骤(1)得到的LPOR基因的所述DNA序列进行PCR扩增；(3)双酶切将步骤(2)得到的PCR产物纯化后分别用BspHI/BamHI双酶切，同时将所述原核表达载体用BspHI/BamHI双酶切，回收酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段；(4)LPOR表达载体构建将步骤(3)得到酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段，按10:1-5:5的比例混合连接，并将得到的连接产物转入感受态细胞中，得到LPOR表达载体；(5)LPOR表达载体的筛选将步骤(4)得到的所述LPOR表达载体挑取在筛选平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，提取质粒，酶切验证正确后测序确认；将测序结果正确的LPOR表达载体保存备用。(6)LPOR蛋白表达将步骤(5)中构建好的LPOR表达载体转入原核表达菌株中，在25-37℃下培养24-48h，加入诱导剂表达LPOR蛋白。2.根据权利要求1所述的一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，步骤(1)中所述原核表达载体为pEHISTEV、pBADHISTEV1、pEBMSCHIS或pEBSRCTEVC10HIS中的一种。3.根据权利要求1所述的一种LPOR蛋白的表达方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，孙文丽，
申请(专利权)人：浙江善测禾骑士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33