本发明专利技术提供一种偶联抗体的合成和应用，公开了Hα1-210-DEC205偶联抗体合成方法：包括以下步骤：①Hα1-210蛋白表达、纯化、鉴定，②DEC-205单克隆抗体，③Hα1-210-DEC205偶联抗体合成；同时公开了Hα1-210-DEC205偶联抗体的体外细胞系实验方法和在体分析方法。本发明专利技术的有益效果是不降低机体免疫力的情况下，仅抑制针对AchR的异常免疫应答，起到治疗MG的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学
，尤其是涉及一种偶联抗体的合成、检测方法和应 用。
技术介绍
重症肌无力（myastheniagravis，MG)是由乙酰胆碱受体 (acetylcholinereceptor，AchR)抗体介导、T细胞依赖、补体参与的神经-肌肉接头处的自 身免疫性疾病，体液免疫和细胞免疫均参与其发病。引发MG症状的直接原因是B细胞产生 的AchR特异性抗体，然而该抗体的产生离不开AchR特异性T细胞的辅助。实验性自身免 疫性重症肌无力（EAMG)是研究MG发病机制及治疗手段的理想模型。 树突状细胞（dendriticcells，DC)是迄今发现功能最强的专职抗原递呈细 胞，近年来的研究表明DC在诱导和维持机体免疫耐受中发挥着重要作用，尤其是未成熟 DC(immaturedendriticcells，iDC)可通过多种机制诱导抗原特异性T细胞耐受，在移植免 疫耐受诱导、自身免疫性疾病治疗方面，展现出其独特的应用价值。 为了寻求一种特异性的治疗MG的方法，即在不降低机体免疫力的情况下，仅抑制 针对AchR的异常免疫应答，本专利技术从iDC入手，将MG的自身抗原-AchRα1亚单位胞外段 (Ηα1-210)蛋白与DC表面特异性受体-DEC205单克隆抗体偶联，合成Ha1-210-DEC205偶 联抗体，体内靶向iDC，诱导AchR特异性Τ细胞耐受，为MG的治疗提供了新的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种偶联抗体的合成和应用，为MG及多种自身免疫性疾病 的治疗提供新的思路和理论依据。 本专利技术的技术方案是：一种偶联抗体的合成方法，包括以下步骤：①Ηα1-210蛋白表达、纯化、鉴定：采用RT-PCR的方法从表达人AchR的细胞系 TE671中扩增AchRa1亚单位胞外段基因（Ηα1-210)，同原核表达载体pET16b连接，构建 重组表达载体，转化BL21感受态菌，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定蛋白的表达；Ni2+亲和 层析柱纯化表达的蛋白。 ②DEC-205单克隆抗体纯化：MiniPerm系统中连续旋转培养分泌DEC-205，GL-117 单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞，培养上清超滤浓缩后经50%饱和硫酸胺沉淀，最后经蛋白 A/G亲和层析柱纯化； ③Ha1-210-DEC205偶联抗体合成：纯化后的抗体经2-巯基乙胺·盐酸还原后， 同异型双功能交联剂SMCC活化的Ha1-210蛋白混合，4°C过夜连接，SDS-PAGE鉴定偶联抗 体的合成；ELISA分别检测偶联后Ha1-210蛋白以及DEC-205抗体的活性。 本专利技术的另一方面，还包括Ha1-210-DEC205偶联抗体的体外细胞系实验方法， 包括以下步骤： ①抗体标记及iDC培养：生物素标记表达纯化的Ha1-210-DEC205、 Ha1-210-GL117偶联抗体以及Ηα1-210;无菌取C57BL/6小鼠（B6鼠）骨髓细胞，体外诱 导培养iDC; ②亲和力检测：将生物素标记的偶联抗体同iDC共孵育后以PE-Avidin染色、流式 细胞仪（FlowCytometry，FCM)分析Ha1-210-DEC205 与iDC的亲和力； ③体外T细胞增殖实验：通过皮下注射Ηα1-210与完全弗氏佐剂 (completefreund'sadjuvant，CFA)的方案免疫Β6鼠构建EAMG模型；无菌取EAMG鼠脾脏 和淋巴结，制备单细胞悬液，抗小鼠CD4抗体免疫磁珠分离T细胞，作为反应细胞；分别加入 不同偶联抗体与丝裂霉素C预处理的iDC共孵育体系，BrdU掺入法分析T细胞的增殖； ④凋亡检测：FITC-AnnexinV/PI染色分析T细胞的凋亡；⑤细胞因子的检测：ELISA检测培养上清中IFN-γ、TGF-a、IL-2、IL-4、IL-10等 相关细胞因子的表达。 本专利技术的另一方面，还包括Ha1-210-DEC205偶联抗体在体分析方法，包括以下 步骤： ①体内靶向iDC:将生物素标记的不同偶联抗体皮下注射EAMG动物模型，注射 后24h，无菌取小鼠腹股沟淋巴结，制作冰冻切片，Avidin-PE(red)染色，同时结合FITC 标记抗⑶11c、抗B220、以及抗⑶3的抗体染色（green)，激光扫描共聚焦显微镜观察 Ha1-210-DEC205偶联抗体对iDC的靶向性； ②EAMG病情影响：偶联抗体同上治疗4周后评估EAMG症状的变化；ELISA法检测 血清抗AchR抗体水平； ③免疫耐受检测：取引流淋巴结体外培养，抗CD11C抗体免疫磁珠分离DC并鉴定 其表型；抗CD4抗体分离T细胞并分别给予相关刺激后观察AchR特异性T细胞免疫耐受； 培养细胞以⑶4、⑶25抗体标记后，FCM分析Treg细胞的含量； ④长期治疗作用观察：偶联抗体同上作用后继续饲养EAMG小鼠2月，观察其长期 治疗作用、测定AchR抗体水平、观察神经肌接头超微结构变化。 本专利技术的另一方面，还包括Ha1-210-DEC205偶联抗体在自身免疫性疾病的治疗 上的应用。 优选的，还包括Ha1-210-DEC205偶联抗体在MG治疗上的应用，可体内靶向iDC， 诱导AchR特异性免疫耐受的形成。 本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术通过化学的方法将Ηα1-210与DC表面 特异性受体-DEC205单克隆抗体偶联，合成Ηa1-210-DEC205偶联抗体，体内靶向iDC，使其 有效摄取、递呈抗原给AchR特异性T细胞，在与T细胞相互作用时通过使T细胞发生无能、 凋亡或激活调节T细胞以及表型转移等机制诱导AchR特异性免疫耐受的形成。【附图说明】 图1是重组载体pET16b_Hα1-210构建。 图2是蛋白纯化的SDS-PAGE分析 图3是ELISA检测Ηα1-210蛋白的活性 图4是C57BL/6小鼠EAMG症状的评估 图5是EAMG大鼠血清抗体水平测定 图6是DC扫描电镜图像 图7是FCM分析、DC表型鉴定 图8是EAMG小鼠血清中anti-R97-116IgG水平。 图9是EAMG小鼠血清中anti-AChRα亚基IgG水平。【具体实施方式】 下面结合附图对本专利技术做详细说明。 本专利技术的一种偶联抗体的合成，包括以下步骤： (1)基因克隆：培养表达人AchR的细胞系TE671，Trizol提取细胞总mRNA， Invitrogen反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增AchRa1亚单位胞外段（Ηα1-210)基因片 段上游引物：5'GCGCATATGTCCGAACATGAGACCCGTCT3'，下游引物：5'ATCGGATC ￡TCCAGGCGCTACATGACGAAGT3'（下划线分别为Ndel和BamHI的酶切位点）。 (2)载体构建：将上述基因片段和pET16b原核表达载体以Ndel和BamHI酶切后， 按照载体：片段~1:5的比例，使用T4DNA连接酶于16°C过夜连接目的片段与载体。将 连接产物转化DH5α菌株，挑取阳性菌落培养后，取菌液小提质粒，Ndel和BamHI双酶切及 测序鉴定片段正确。 (3)Ηα1-210蛋白表达、鉴定和纯化：选取鉴定正确的如图1所示的重组载体 pET16b-Ha1-210,转化BL21 (DE3)pLysS感受态菌，转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种偶联抗体的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：①Hα1‑210蛋白表达、纯化、鉴定：采用RT‑PCR的方法从表达人AchR的细胞系TE671中扩增AchRα1亚单位胞外段基因Hα1‑210，同原核表达载体pET16b连接，构建重组表达载体，转化BL21感受态菌，IPTG诱导表达；②DEC‑205单克隆抗体纯化：MiniPerm系统中连续旋转培养分泌DEC‑205，GL‑117单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞，培养上清超滤浓缩后经50％饱和硫酸胺沉淀，最后经蛋白A/G亲和层析柱纯化；③Hα1‑210‑DEC205偶联抗体合成：纯化后的抗体经2‑巯基乙胺·盐酸还原后，同异型双功能交联剂SMCC活化的Hα1‑210蛋白混合，4℃过夜连接。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：常婷，林宏，李柱一，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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