本发明专利技术公开了一种通式（I）的维生素D3的偶联物，由维生素D3半抗原与产生抗原性的载体物质优选牛血清蛋白偶联构成，其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素D3的分子数，n为整数1~20，BSA为牛血清蛋白，分子量范围是6.6KDa~6.9KDa。本发明专利技术还公开了所述的偶联物制备方法，即将维生素D3与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明专利技术具有特异性好、准确度高，快速简便的特点，为用所述偶联物制备维生素D3的酶联免疫检测试剂提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脂溶性维生素，尤其涉及维生素D3的 偶联物及其制备方法与应用。属于维生素免疫检测领域。
技术介绍
本专利技术涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书： BSA :牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin), Sigma 公司产品 PBS:磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline) (0.01M,pH= 7.40) cBSA:经乙二胺修饰的牛血清蛋白 透析膜：美国联合炭化（United Carbide)公司产品 维生素D3:中国标准品质检所 CDI :N，N'_羰基二咪唑，Sigma公司产品 DMAP: 4-二甲氨基P比啶，Sigma公司产品 维生素D是一种脂溶性类固醇激素前体，主要由皮肤经光照后产生。维生素D本身无 生物活性，必须在肝脏和肾脏相继接收2次羟基化才能生成具有生物活性的1，25-羟基维 生素D。维生素D的两种重要形式包括维生素D 3 (胆钙化醇）和维生素D2 (麦角钙化醇)。 维生素D3 (胆钙化醇）主要是由人体自身合成的，人体的皮肤含有一种胆固醇，经阳光照射 后，就变成了维生素D3。所以，如果孩子能充分接受阳光直射皮肤4-6小时以上的话，自身 合成的维生素D 3，就基本上能满足。但是紫外线照射带来的皮肤癌上升、空气的污染、各地 天气变化等问题的影响下，各国人群接受日照的时间都在减少，并且很多国家明确规定要 限制接受日照的时间，因此全世界范围内维生素D均呈现广泛缺乏的现象。 中国营养协会建议中国儿童和成人的可耐受最高摄入量为800IU/d。但从国 际对D 3的应用看来，大部分国家在日照较少的季节，对婴幼儿的日摄入量已经提高到 800-1000IU/d，而孕妇和普通成人如果检测为维生素D3缺乏，在开始1-2个月，日摄入量会 要求提高到2000 IU/d甚至更多。通过膳食来源的维生素D3-般不会引起中毒，也就是说 天然的维生素D3，和食品级的天然维生素D 3补充剂一般不会引起中毒。而大剂量的化学维 生素D3和强化维生素D 3的奶制品有发生维生素D 3过量和中毒的可能。因此，检测营养强 化食品中维生素D3的含量非常有必要。
技术实现思路
在脂溶性维生素含量检测中，仪器法如液相色谱法和质谱等是应用最广泛的方 法。虽然这些方法准确，稳定，可靠，但是由于仪器法价格昂贵，费事较长，且造成有机溶剂 污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于应用于现场操作。酶联免疫检测 法（ELISA)提供了一种极好的检测手段。该方法具有快速，准确，简易，不需要专人操作等 优点，这使得ELISA法成为一种理想的检测手段。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的 抗体。维生素D3是一种小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之半抗原。所以，必须把微 生物D3转化为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，世界 上尚未有关于维生素D3的免疫原合成及抗体制备过程的报道，而且维生素D3的ELISA试 剂盒大都购于国外，保存期短，价格高，远不能满足检测需要，因此研究维生素D3的免疫原 的合成及抗体制备显得格外重要。【具体实施方式】 实施例1 (1)溶液A的制备：在50mL圆形反应瓶内，搅拌中（120转/分钟)，加入维生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反应4小时生成维生素D3与⑶I的活性中间体。 (2)溶液 B 的制备：在 25°C下，取 cBSA171mg (0? 0025mmol)溶于 15mL PBS (pH = 7. 4，0. 01M)中。在磁力搅拌下（120转/分钟）将A液逐滴加入B液中，反应6小时得溶 液B0 (3)制备维生素D3免疫原：将溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小时 更换一次透析液，连续透3天。然后，用蒸馏水透3天，每8小时更换一次透析液。收集透 析液冻干，得到150mg白色固体粉末。通过紫外吸收光谱(吸收值)确定产物偶联情况。本 专利技术的维生素D3的免疫原在274nm处有特征紫外吸收峰。 实施例2 (1)溶液A的制备：在50mL圆形反应瓶内，搅拌中（120转/分钟)，加入维生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反应6小时生成维生素D3与⑶I的活性中间体。 (2)溶液 B的制备：在 28°C下，取 cBSA225. 72mg(0? 0033mmol)溶于 15mL PBS(pH =7. 4，0. 01M)中。在磁力搅拌下（120转/分钟）将A液逐滴加入B液中，反应6小时得 溶液B。 (3)制备维生素D3免疫原：将溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小时 更换一次透析液，连续透3天。然后，用蒸馏水透3天，每8小时更换一次透析液。收集透 析液冻干，得到165mg白色固体粉末。通过紫外吸收光谱(吸收值)确定产物偶联情况。本 专利技术的维生素D3的免疫原在274nm处有特征紫外吸收峰。 实施例3 (1)溶液A的制备：在50mL圆形反应瓶内，搅拌中（120转/分钟)，加入维生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反应8小时生成维生素D3与⑶I的活性中间体。 (2)溶液 B 的制备：在 30°C下，取 cBSA114. OOmg (0? 0017mmol)溶于 15mL PBS(pH =7. 4，0. 01M)中。在磁力搅拌下（120转/分钟）将A液逐滴加入B液中，反应6小时得 溶液B。 (3)制备维生素D3免疫原：将溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小时 更换一次透析液，连续透3天。然后，用蒸馏水透3天，每8小时更换一次透析液。收集透 析液冻干，得到135mg白色固体粉末。通过紫外吸收光谱(吸收值)确定产物偶联情况。本 专利技术的维生素D3的免疫原在274nm处有特征紫外吸收峰。【主权项】1. 一种维生素D3的偶联物，由维生素D3半抗原与产生免疫原性的载体蛋白偶联构成， 所述载体蛋白物质为优选蛋白。2. 如权利要求1所述的维生素D3的偶联物，其中所述的蛋白质是牛血清蛋白。3. 如权利要求2所述的维生素D3的偶联物，其结构通式为（I);(I) 其中m:为与一个牛血清蛋白结合的分子数，n为整数1~20 BSA为牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin),分子量范围是 6. 6KDa~6.9KDa 上述偶联物显示出如下物化特征： 外观：白色粉末固体 紫外吸收光谱：265nm。4. 如权利要求3所述的维生素D3的偶联物，其特征是：所述n优选为整数10~20,分子 量范围是 6. 7KDa~6. 8KDa。5. 权利要求1~4中任一项所述的维生素D3的偶联制备方法，其特征是，将维生素D3与 产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种维生素D3的偶联物，由维生素D3半抗原与产生免疫原性的载体蛋白偶联构成，所述载体蛋白物质为优选蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郗日沫，董亚庆，尹永梅，孟萌，李小刚，张丽沙，王玉芬，宋兆瑞，龙浩，许坤，
申请(专利权)人：南开大学，天津三箭生物技术有限公司，李小刚，
类型：发明
国别省市：天津;12
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