一种rTRAIL突变体及其海兔毒素偶联物。本发明专利技术公开了一种rTRAIL突变体，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明专利技术还公开了所述rTRAIL突变体的编码基因及含有该编码基因的表达单元、重组载体或表达系统。本发明专利技术还公开了一种rTRAIL突变体-vcMMAE偶联物及其制备方法和应用。本发明专利技术偶联物具有rTRAIL突变体和MMAE两者的生物学功能，通过rTRAIL突变体与肿瘤细胞表面的死亡受体特异结合，将MMAE定向转运到肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内释放发挥作用，既可杀伤对TRAIL敏感性低甚至抵抗的肿瘤细胞，也减少MMAE单独给药产生的毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和药物领域，尤其涉及一种rTRAIL突变体及其海兔毒素偶联物。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL，或Apo2L，TNFSF10)是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子，为一种抗癌应用前景良好的生物药物。TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的，因其氨基酸序列具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名。TRAIL属II型跨膜蛋白，由281个氨基酸组成，其N端(f 17位氨基酸)位于胞内，C端(第39 281位氨基酸)延伸到胞外，其中第11Γ281位是发挥主要功能的部位。许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡，但对正常细胞无毒副作用。目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的I、II期临床试验，并取得初步疗效。另外，TRAIL对NF-K B仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应，这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。TRAIL在免疫系统细胞中表达，包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞和树突细胞，并且位于细胞膜中，可经半胱氨酸蛋白酶加工成可溶形式。TRAIL是通过与与其细胞膜受体结合发挥诱导凋亡作用的。目前已发现5种TRAIL受体，包括TRAIL-R1 (DR4，TNFSFIOa)和TRAIL-R2 (DR5, TNFRSFIOb)；TRAIL-R3 (DcRl，TNFRSFlOc)和 TRAIL-R4 (DcR2, TNFRSFlOd)；循环骨保护素(OPG，TNFRSFllb)。DR4和DR5具有一段死亡结构域(DD)，是TRAIL结合受体后诱导凋亡所必需的。其余三个受体由于缺乏功能性死亡结构域，虽然能与TRAIL结合，但无法诱导凋亡。TRAIL与DR4或DR5结合后可激活线粒体依赖和非线粒体依赖两条细胞凋亡信号途径，介导死亡信号传导入细胞内，启动效应物半胱天冬酶-3 (caspase-3)，最终引起肿瘤细胞凋亡。近年来，人们发现重组可溶TRAIL诱导了广谱的人肿瘤细胞系凋亡，但同时也存在一些对TRAIL敏感性较低或耐受的肿瘤细胞，如所有的人黑色素瘤细胞系、大部分乳腺癌细胞系、前列腺癌细胞系LNcaP等，这些细胞表面虽然或多或少也表达DR4或DR5，却由于细胞内凋亡途径中关键酶的缺失、突变和其他抑制凋亡的蛋白高表达等原因，导致TRAIL结合DR4或DR5之后并不能引起细胞的最终凋亡。对于这类细胞所形成的实体瘤，亟须其他治疗手段或改造TRAIL使之具备杀伤敏感性低以及耐受肿瘤细胞的能力。研究发现，可溶型重组TRAIL (rTRAIL)与放化疗联合应用能提高肿瘤细胞对rTRAIL的敏感性，二者具有协同作用。目前国际通用的rTRAIL是95^281位氨基酸片段，rTRAIL单体倾向于形成生物活性较好的三聚体而存在，在三聚体的顶部有一个锌离子结合位点，对稳定三聚体构象起重要作用。但联合治疗方案仅是将rTRAIL和这些药物同时给药，并未在二者之间建立联系，无法将这些药物单一地导向肿瘤细胞，因此一般只选择低剂量低毒性的药物，以免对正常细胞产生毒害。相应地，也就无法得到更好的治疗效果。因此，若能将一些能够强力杀伤肿瘤细胞的药物加以有效利用，将更有利于肿瘤的治疗。例如化疗药物海兔毒素(MonomethylauristatinE, MMAE)是一种人工合成抗肿瘤小分子,它通过抑制细胞内微管蛋白二聚化而诱导细胞凋亡。但由于它具有很强的无选择毒性，会对正常细胞造成伤害，所以其本身并不能成药。另外，针对TRAIL的突变体、TRAIL受体的抗体的研究都在进行中，但治疗效果仍不理想。
技术实现思路
本专利技术提供了一种rTRAIL突变体，将特定氨基酸突变为半胱氨酸，从而实现与海兔毒素的偶联，且不会大幅降低蛋白对肿瘤细胞的杀伤力。一种rTRAIL突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。·该突变体取自全长TRAIL蛋白的第95 281个氨基酸，且第109位的天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)。本专利技术还提供了一种编码所述rTRAIL突变体的基因，碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。该基因第109位编码天冬酰胺(Asn)的密码子AAT突变为编码半胱氨酸(Cys)的密码子 TGT。本专利技术还提供了一种含有所述基因的表达单元、重组载体或表达系统。所述表达单元的启动子为T7，在这些启动子的作用下，rTRAIL突变体可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。所述重组载体的原始载体为pET_28a ( + )。所述表达系统可选细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统，优选为细菌表达系统，最优选为大肠杆菌表达系统。本专利技术还提供了一种rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物，由海兔毒素通过连接臂偶联rTRAIL突变体三聚体构成。所述海兔毒素的合成方法参考美国专利文献Tumerinhibiting tetrapeptide bearing modified phenethylamides,(专利号5,635, 483)。本专利技术所使用的连接臂为马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽，其合成方法参考文献Gene M. D. , et al, Cathepsin B-Labile Dipeptide LinkersforLysosomal Release of Doxorubicin from Internalizing Immunoconjugates:ModelStudies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In VitroAnticancerActivity,Bioconjugate Chem.，13(4)855-869(2002).。本专利技术带连接臂的海兔毒素(vcMMAE)由江阴康诺泰生物技术有限公司代为合成，也可以参考文献(Svetlana 0. D. , et al, Development of potentmonoclonal antibodyauristatin conjugates for cancer therapy, NatureBiotechnology. , 21 (7) 778-784(2003).),偶联时再通过缬氨酸上的马来酰亚胺与rTRAIL突变体的半胱氨酸巯基进行烷基化反应，最终形成本专利技术偶联物。本专利技术还提供了所述rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物的制备方法，包括(I)将rTRAIL突变体多聚体解聚，重新聚合得到rTRAIL突变体三聚体，具体包括将rTRAIL突变体溶于含锌离子的缓冲液中，加入磷酸三(β -氯乙基)酯，3(T40°C水浴反应I 3h ；由于rTRAIL突变体之间会通过二硫键形成多聚体，加入磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)使不稳定的多聚体解聚，保持单体状态，反应体系中的锌离子进一步促使rTRAIL突变体单体形成稳定的三聚体。(2)将rTRAIL突变体三聚体与带连接臂的海兔毒素混合，进行偶联反应，偶联后，每个三聚体可以结合1-3个海兔毒素分子；偶联本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种rTRAIL突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈枢青，潘利强，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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