一种药物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤药物研究领域，尤其涉及一种药物组合物及其应用，所述组合物包括PD‑1抗体和非特异性扩增激活T细胞。本发明专利技术药物组合物包括PD‑1抗体和非特异性扩增激活T细胞，两种组分协同作用，能够明显抑制肾癌细胞的生长，并对肾癌细胞具有杀伤作用，且本发明专利技术药物组合物对肾癌有明显的治疗效果，按RESIST标准评价均达到PR(部分缓解)或接近CR(完全缓解)，有效率达100％，而副作用都十分微小，无3或4级不良反应发生。

Pharmaceutical composition and application thereof

The present invention relates to a cancer drug research field, especially relates to a pharmaceutical composition and application thereof, the composition including the activation of T cells PD 1 antibody and non-specific amplification. The pharmaceutical composition of the invention includes the activation of T cells PD 1 antibody and non-specific amplification, two components of synergistic effect, can inhibit the growth of renal carcinoma cell, and has cytotoxic effect on renal cell carcinoma, and the medicine composition has obvious therapeutic effect on renal cell carcinoma, according to the RESIST evaluation standard are PR (partial remission) or close to CR (complete remission), the effective rate was 100%, and the side effects are very small, no 3 or 4 adverse reactions.

【技术实现步骤摘要】
一种药物组合物及其应用
本专利技术涉及肿瘤药物研究领域，尤其涉及一种药物组合物及其应用。
技术介绍
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。肾癌是一种严重危害人类健康的恶性疾病遥大多数晚期肾癌对放化疗不敏感袁且预后较差，细胞免疫治疗对肿瘤的生物治疗取得了良好效果并逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。近年细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkiller,CIK)的免疫功能得到广泛研究，CIK细胞作为一种新型的广谱抗肿瘤免疫细胞，不仅具有强大的广谱抗肿瘤效应，而且可以调节增强肿瘤患者的免疫功能。程序性死亡受体1(ProgrammedDeath-1；PD-1)，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员,其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1主要是在激活的T细胞和B细胞中表达，具有抑制细胞激活的功能，这是免疫系统中一种正常的自稳机制，因为过度的T/B细胞激活会引起自身免疫疾病，所以PD-1相当于人体内的一道护栏。CN105326893A公开了一种抗癌组合物及其制剂。该组合物包括DC-CIK细胞和康艾注射液。该专利技术将DC-CIK细胞与康艾注射液联合使用时，在药物用量减少的情况下效果更好，可有效治疗癌症。该抗癌组合物针对性不强，也没有有力的证据可以证明其对癌症有显著的治疗效果。CN105744955A公开了包含抗CEACAM1抗体的组合物、包含能够抑制或阻断PD-1和其配体之间相互作用的抗体的组合物，以及在治疗癌症中所述组合物组合使用的方法。该专利技术将PD-1抗体单独施用或与别的抗体结合，其针对性不强，也没有有力的证据证明其对癌症有明显的治疗效果。
技术实现思路
针对目前存在的问题，本专利技术提供一种药物组合物及其应用，所述药物组合物包括PD-1抗体和非特异性扩增激活T细胞，该药物组合物对肾癌有明显的治疗效果，按RESIST标准评价均达到PR(部分缓解)或接近CR(完全缓解)，有效率达100％，而副作用都十分微小，无3或4级不良反应发生。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种药物组合物，所述组合物包括PD-1抗体和非特异性扩增激活T细胞。本专利技术中，非特异性扩增激活T细胞指的是CD8+T、CD4+T经过扩增激活后，获得的一类具有广谱杀伤功能的CD8CD4混合T淋巴细胞群，由患者外周血中的T淋巴细胞经多种细胞因子活化扩增而成，具有正向免疫调节作用，如它们能分泌多种细胞因子如IFN-γ、IL-2等，还能抑制免疫抑制细胞如MDSC等，非特异性扩增激活T细胞回输到患者体内后，它们能进入肿瘤组织中。在肿瘤组织的微环境中，它们发挥免疫调控的作用，通过分泌的IFN-γ等细胞因子诱导肿瘤细胞表达PD-1的配体PD-L1，并抑制肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，发挥免疫调控作用。PD-1抗体主要通过阻断肿瘤组织中T淋巴细胞上的PD-1分子与PD-L1结合，重新活化T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。但由于肿瘤微环境中免疫抑制因素如MDSC及Treg等细胞的存在，减低了PD-1抗体对T淋巴细胞的再活化作用。非特异性扩增激活T细胞能抑制肿瘤微环境的免疫抑制细胞，因而能增强PD-1抗体的作用。根据本专利技术，所述PD-1抗体为从商业途径可以购买得到的PD-1抗体都是可行的，不同购买途径的PD-1抗体不会对本申请的药物组合物的药效造成影响，本申请的PD-1抗体购买自Keytruda，PD-1抗体为美国FDA已批复的处方药，所述PD-1抗体的浓度为1-10mg/kg，例如可以是1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg或10mg/kg，优选为1-5mg/kg，进一步优选为2mg/kg，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。根据本专利技术，所述非特异性扩增激活T细胞的数量为(3-12)×109个，例如可以是3×109个、3.1×109个、3.2×109个、3.3×109个、3.5×109个、3.8×109个、4×109个、4.2×109个、4.5×109个、4.8×109个、5×109个、5.3×109个、5.5×109个、5.8×109个、5.83×109个、6×109个、6.5×109个、7×109个、7.5×109个、8×109个、8.5×109个、9×109个、9.5×109个、10×109个、10.5×109个、11×109个、11.5×109个或12×109个，优选为(6-10)×109个，进一步优选为5.83×109个，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。优选地，所述非特异性扩增激活T细胞的制备方法包括如下步骤：(1)抽取患者外周血，离心；(2)离心后的上层血浆放入4℃冰箱中保存，用生理盐水稀释下层血细胞，稀释后的血细胞加至淋巴细胞细胞分离液上层，离心；(3)离心后提取单个核细胞，用生理盐水洗涤，进行细胞计数；(4)细胞计数后接种在包被过重组人纤粘连蛋白(RetroNectin)、CD3单抗和PBS的培养瓶内，加入完全培养液50-60mL，放入5％CO2培养箱中，37℃进行非特异性扩增激活T细胞的培养；(5)隔日显微镜下观察，根据细胞状态和数量补充完全培养基；(6)10-20d，优选14d后非特异性扩增激活T细胞成熟，用生理盐水洗涤，重悬后低速离心，弃上清，用含有20％白蛋白的生理盐水重悬细胞。本专利技术中，研究发现在淋巴细胞培养体系中加入RetroNectin，促使细胞由G1期进入S期，可以使细胞获得上万倍的细胞增值率。RetroNectin与CD3单抗联合包被，Retronectin参与细胞的附着、伸展、分化和增殖的同时，也增加了CD3单抗与非特异性扩增激活T细胞的接触、附着，即增加了CD3单抗的作用，进一步提高了非特异性扩增激活T细胞的扩增培养效率。优选地，步骤(1)所述离心的条件为500-1000g，4℃离心10-20min，优选为800g、4℃离心15min。所述离心的转速为500-1000g，例如可以是500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g或1000g，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述离心的时间为10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括PD‑1抗体和非特异性扩增激活T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括PD-1抗体和非特异性扩增激活T细胞。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述PD-1抗体的浓度为1-10mg/kg，优选为1-5mg/kg，进一步优选为2mg/kg；优选地，所述非特异性扩增激活T细胞的数量为(3-12)×109个，优选为(6-10)×109个，进一步优选为5.83×109个。3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述非特异性扩增激活T细胞的制备方法包括如下步骤：(1)抽取患者外周血，离心；(2)离心后的上层血浆放入4℃冰箱中保存，用生理盐水稀释下层血细胞，稀释后的血细胞加至淋巴细胞细胞分离液上层，离心；(3)离心后提取单个核细胞，用生理盐水洗涤，进行细胞计数；(4)细胞计数后接种在包被过重组人纤粘连蛋白、CD3单抗和PBS的培养瓶内，加入完全培养液50-60mL，放入5％CO2培养箱中，37℃进行非特异性扩增激活T细胞的培养；(5)隔日显微镜下观察，根据细胞状态和数量补充完全培养基；(6)10-20d，优选14d后非特异性扩增激活T细胞成熟，用生理盐水洗涤，重悬后低速离心，弃上清，用含有20％白蛋白的生理盐水重悬细胞；优选地，步骤(1)所述离心的条件为500-1000g，4℃离心10-20min，优选为800g、4℃离心15min；优选地，步骤(2)所述的生理盐水和血细胞的体积比为(1-3):1，优选为1:1；优选地，步骤(2)所述离心的条件为500-1000g，16-23℃离心10-20min，优选为800g、20℃离心17min；优选地，步骤(3)所述洗涤的次数为1-5遍，优选为2-3遍；优选地，步骤(4)所述的完全培养基为无血清培养基中加入800-1200IU/mLIL-2、800-1200IU/mLIFN-γ、100-200IU/mL庆大霉素、50-150IU/mLIL-1N和1-8％自体血浆，优选为1000IU/mLIL-2、1000IU/mLIFN-I、160IU/mL庆大霉素、100IU/mLIL-1α和5％自体血浆；优选地，步骤(4)所述细胞计数后将细胞进行CD4和CD8磁珠分选，并将获得的CD4+T细胞和CD8+T细胞进行混合；优选地，所述CD4+T细胞和CD8+T细胞的细胞数量比为1:1；优选地，步骤(6)所述的洗涤后进行离心，离心的条件为100-500g，4℃离心5-16min，优选为300g、4℃离心8min。4.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述非特异性扩增激活T细胞的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：高全立，韦丹，
申请(专利权)人：河南省华隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41