酵母表达重组SEA-GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用制造技术

本发明专利技术涉及酵母表达重组SEA‑GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用。具体地，本发明专利技术提供一种优化的适合毕赤酵母表达的SEA‑GPI融合蛋白的编码序列，以及高效生产所述融合蛋白的方法。优化后的SEA‑GPI融合蛋白基因非常适合酵母表达，具有高表达、高稳定的特点。本发明专利技术可高效、简便、低成本地获得SEA‑GPI融合蛋白。本发明专利技术还提供了含所述SEA‑GPI融合蛋白的药物组合物。

Preparation of recombinant SEA-GPI fusion protein expressed in yeast and its application in antitumor

The present invention relates to preparation of recombinant yeast expression SEA GPI fusion protein and its application in treating tumor. Specifically, the present invention provides an optimal fit for expression in Pichia pastoris SEA GPI fusion protein encoding sequence, and a method for efficient production of the fusion protein. The optimized SEA GPI fusion protein gene is very suitable for yeast expression, has the characteristics of high expression and high stability. The invention can be efficient, simple and low cost to obtain SEA GPI fusion protein. The invention also provides pharmaceutical compositions containing the SEA GPI fusion protein.

【技术实现步骤摘要】
酵母表达重组SEA-GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用
本专利技术涉及了基因工程和医药领域。具体地，本专利技术涉及酵母表达重组SEA-GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用。更具体地，本专利技术涉及优化的适合酵母表达的SEA-GPI融合蛋白的编码序列，以及高效生产SEA-GPI融合蛋白的方法。本专利技术还涉及含有SEA-GPI融合蛋白的药物组合物。
技术介绍
肿瘤已经成为当前威胁人类生命健康安全的重要疾病。在我国，恶性肿瘤的死亡率已经位居所有疾病的榜首。针对肿瘤的发病机制、各种诊疗方法的研究一直是肿瘤研究的热点。近年来，关于肿瘤生物治疗的措施和手段有了诸多新改进，开辟了很多新途径，取得了很多令人瞩目的成果。2013年底Science杂志将肿瘤的生物治疗成果列为当年度十大科技进展之一，更是掀起了肿瘤生物治疗的新热潮。当前研究认为肿瘤细胞逃逸免疫监视的机制包括：1)MHC分子的下调或丢失；2)抗原传递通路的变化导致无法将肿瘤特异性抗原递呈给T细胞；3)激活宿主免疫应答必需的共刺激分子或黏附分子的缺失；4)肿瘤局部的细胞因子缺乏或肿瘤细胞分泌抑制性因子；5)肿瘤抗原丢失或抗原调变等。因此提高机体免疫细胞识别肿瘤特异性抗原的能力、更有效地激发机体抗肿瘤免疫应答的效力与强度成为肿瘤生物治疗研究的主要研究方向。超抗原(superantigen，SAg)是指一组由细菌或病毒编码的具有免疫刺激作用的蛋白分子。超抗原不需要抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)的加工，直接以完整的蛋白质分子形式与APC膜上的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)Ⅱ类分子抗原肽结合槽外侧区结合，导致带有特异性Vβ节段T细胞大量活化增殖。超抗原只需极低浓度即可活化大量的淋巴细胞克隆，其活化T细胞的效力是普通抗原的数千倍以上，可强烈激发细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte，CTLs)细胞毒活性和一系列细胞因子的产生，是迄今为止已知的T细胞的最强的有丝分裂原，是一种强大的T细胞激活剂。葡萄球菌肠毒素A蛋白(staphylococcalenterotoxinA，SEA)是目前研究最为广泛的超抗原家族(SEA、SEB、SEC、SED、SEE等)成员之一，近年来已被广泛应用于肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的研究和治疗中。有研究认为，制备重组的SEA锚定蛋白，可以便捷地将SEA固定到多种肿瘤细胞上制备SEA锚定修饰的肿瘤瘤苗，借助超抗原SEA强烈的激发抗肿瘤作用，可有效激活机体免疫系统对该肿瘤细胞的杀伤效应，提高机体对该肿瘤的抑瘤效率，而且能够减低直接使用SEA基因载体转染肿瘤细胞带来的副作用，有望成为肿瘤生物治疗的新型制剂。目前国内外针对SEA锚定修饰瘤苗已经进行了一些研究，部分研究涉及将超抗原SEA序列与一些锚定序列进行融合。然而，目前开发的构建SEA锚定蛋白的真核表达体系，存在明显的缺点，例如制备纯化SEA融合蛋白的周期长、得率低，成本大，操作程序复杂，不利于工程化开发和临床应用推广。此外，也有研究涉及通过原核表达体系制备SEA锚定蛋白，例如使用pET-28a原核载体在大肠杆菌中表达了SEA锚定蛋白，但是原核载体表达SEA锚定蛋白的效率低下。此外，采用原核载体构建SEA锚定蛋白的技术体系，因为原核表达体系的固有缺陷，导致蛋白表达产物生物活性低，且产生的融合蛋白难以正确地进行蛋白折叠修饰。综上所述，当前利用SEA的抗肿瘤效应构建SEA锚定蛋白修饰的瘤苗细胞可提高机体抗肿瘤效应已经得到了诸多科学实验的验证，但因为表达体系和工艺等的限制，如何克服原核载体表达能力与产物活性差、真核载体制备困难的缺陷，设计构建具有良好生物学效应、产量高、制备更高效、易于开发应用的SEA相关融合蛋白成为研究者面临的难题。因此，本领域迫切需要开发新的高效、简便、低成本地制备高活性SEA锚定蛋白的方法以及相关的抗肿瘤药物。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高效表达和生产SEA-GPI融合蛋白的方法。本专利技术的另一目的是提供相应的编码序列、载体、宿主细胞以及表达和纯化的工艺。在本专利技术的第一方面，提供了一种编码SEA-GPI融合蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEA-GPI融合蛋白的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或式I所示结构的SEA-GPI融合蛋白，而且所述核苷酸序列的SEA-GPI融合蛋白编码区与SEQIDNO:1所示核苷酸序列有≥95％相同性。在另一优选例中，所述核苷酸序列的SEA-GPI融合蛋白编码区与SEQIDNO:1所示核苷酸序列有≥98％相同性。在另一优选例中，所述核苷酸序列的SEA-GPI融合蛋白编码区与SEQIDNO:1所示核苷酸序列有≥99％相同性。在另一优选例中，所述核苷酸序列的SEA-GPI融合蛋白编码区与SEQIDNO:1所示核苷酸序列有100％相同性。在另一优选例中，该编码SEA-GPI融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的第二方面，提供了含有一种表达载体，它含有本专利技术第一方面中所述的核苷酸序列。在本专利技术的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第二方面中所述的表达载体或者基因组中整合有本专利技术第一方面中所述的SEA-GPI融合蛋白的编码序列。在另一优选例中，所述宿主细胞是通过转入本专利技术第二方面中所述的表达载体或第一方面中所述的核苷酸序列并经同源重组而形成的，从而在基因组或染色体中整合有SEA-GPI融合蛋白的编码序列。在另一优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母(PichiaPastoris)。在另一优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母(PichiaPastoris)GS115菌株。在本专利技术的第四方面，提供了一种生产SEA-GPI融合蛋白的方法，它包括以下步骤：(a)在适合表达条件下，培养本专利技术第三方面中所述的宿主细胞，从而表达SEA-GPI融合蛋白，其中所述的宿主细胞是毕赤酵母；(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的SEA-GPI融合蛋白。在另一优选例中，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。在另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的SEA-GPI融合蛋白的编码序列。在本专利技术的第五方面，提供了一种SEA-GPI融合蛋白，所述的SEA-GPI融合蛋白具有式I结构：A-B-C(I)式中，A为SEA元件，其序列如SEQIDNO.:2中第1-233位；B为无或连接肽；C为GPI元件，其序列如SEQIDNO.:2中第234-276位；各“-”为肽键；并且，所述SEA-GPI融合蛋白是酵母表达的重组蛋白。在另一优选例中，所述的SEA-GPI融合蛋白的糖基化的蛋白。在另一优选例中，所述的SEA-GPI融合蛋白是糖基化的分子量为约56kD的蛋白。在本专利技术的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有本专利技术第五方面中所述的SEA-GPI融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述的药物组合物是疫苗组合物或瘤苗组合物。在本专利技术的第七方面，提供了本专利技术第五方面所述的SEA-GPI融合蛋白的用途，它被用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物组合物。在另一优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码SEA‑GPI融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEA‑GPI融合蛋白的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的SEA‑GPI融合蛋白编码区与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有≥95％相同性。

【技术特征摘要】
1.一种编码SEA-GPI融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEA-GPI融合蛋白的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的SEA-GPI融合蛋白编码区与SEQIDNO:1所示核苷酸序列有≥95％相同性。2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，该编码SEA-GPI融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体或者基因组中整合有权利要求1所述的SEA-GPI融合蛋白的编码序列。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，它是毕赤酵母(PichiaPastoris)。6.一种生产SEA-GPI融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)在适合表达条件下，培养如权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张意，于益芝，杨阳，殷书磊，郑翱翔，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31