本发明专利技术目的是提供一种新的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，用于疟疾疫苗的开发。本发明专利技术的Pfs25蛋白突变体，相当于Pfs25天然蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187位的天冬酰胺突变为谷氨酸。本发明专利技术的Pfs25蛋白突变体具有与Pfs25标准蛋白相同的免疫原性，并且在毕赤酵母中高表达，目的蛋白占上清分泌蛋白的70％，因而缩短了发酵周期，简化了纯化方法。本发明专利技术还提供了表达Pfs25蛋白突变体的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于传染病防治领域，具体涉及疟疾的防治，尤其涉及用于传播阻断型恶性疟疾疫苗的候选靶抗原。
技术介绍
疟疾是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上有20亿人口生活在疫区。每年全球大约有3亿人口患病，其中50 %是由恶性疟疾原虫引起的，5岁以下儿童患病人数约为250万，每年死于疟疾的人口约100万-300万。我国疟疾每年患病人数为10 万左右。近年来，随着抗药疟原虫(疟疾病原体)和抗药按蚊(传播媒介)的出现，疟疾的防治面临更大的挑战。疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期，即在有性阶段的配子期和无性阶段的细胞前期及红细胞内期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加之疟原虫的致病机理尚不十分清晰，这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。对疟原虫抗原的研究，人们发现某些特异性抗原，有望成为疟疾疫苗的侯选物。其中一些重要抗原，如在子孢子表面表达的环子孢子蛋白(CSP)、在肝和血两个时期表达的裂殖子表面蛋白(MSP)、在有性阶段表达的合子表面或动合子表面抗原(Pfs^)等，已经作为疟疾候选疫苗的保护性抗原，并取得了初步的成果。1988年Kaslow DC等首次报道了位于合子或动合子表面膜蛋白的Pfs25蛋白质，结果表明该蛋白质由217个氨基酸组成，富含半胱氨酸，其分子特征是存在四个“EGF 样的结构域” (Nature. 1988May 5 ；333 (6168) :74-6.)。1991 年 BarrPJ 等报道了重组 Pfs25蛋白作为传播阻断型疫苗在试验动物上的效果(The Journal of experimental medicine. 1991Nov 1 ； 174(5) :1203-8. )。KaslowDC 等在美国专利 US5217898 公开了酵母表达Pfs25突变体的方法，该突变体称为Pfs25B，由相当于Pfs25天然序列22-188位的氨基酸组成，其中相当于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替换成丙氨酸。2003 年hu L等报道在毕赤酵母中表达pfs25蛋白质突变体，该突变体相当于Pfs25天然序列 23-193位的氨基酸组成，其中相当于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替换成谷氨酰胺(Vaccine. 2003Apr2 ；21 (15) :1650-7.)。尽管上述两种突变体在动物体内表现出传播阻断作用，并进行了 I期临床安全性研究，但在进一步开发中都存在问题。因此本领域迫切需要研制有效的药物或疫苗来防治这种疾病。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，作为传播阻断疫苗的候选抗原。本专利技术要解决的另一问题是提供一种高效、经济的酵母表达Pfs25 蛋白突变体的方法。本专利技术的第一方面，提供了一种恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，该突变体相当于Pf s25天然蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187的天冬酰胺突变为谷氨酸，具体见SEQl。本专利技术的第二方面，提供了一种采用酵母偏爱密码子的编码Pfs25蛋白突变体的核苷酸序列，具体见SEQ2。本专利技术的第三方面，提供了一种在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白突变体的方法，包括如下步骤(1)将Pfs25蛋白突变体编码基因置于三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子的下游， 构建重组酵母菌；(2)以YPD培养基培养重组酵母菌；(3)补加葡萄糖维持发酵液中的葡萄糖终浓度在0. 5 lg/L范围；(4)培养M 72小时，收获培养上清，提取目的蛋白。其中所述的Pfs25蛋白突变体是指相当于Pfs25天然蛋白第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸替换。更优选的，相当于Pfs25天然蛋白第112、165、187 的天冬酰胺被谷氨酸替换。最优选的，Pfs25蛋白突变体是SEQl定义的突变体。在一个优选的方案中，Pfs25重组酵母菌在29. 0°C、pH6. 0 4. 0、溶氧> 20%、条件下发酵培养。在更优选的方案中，发酵过程中发酵过程中转速约350rpm，保持通气速度200L/ h (压缩气体)。在更优选的方案中，发酵液中加入Antifoam 204作为消泡剂。本专利技术的恶性疟原虫Pf s25蛋白突变体(简称Pfs25_3E)，能够与针对Pfs25标准蛋白的单克隆抗体4B7特异性反应，用于小鼠免疫，能够诱导产生高滴度的抗Pfs25抗体， 是一种可用于阻断传播疫苗研制的良好的候选抗原。与现有技术报道的Pfs25蛋白突变体(简称Pfs25_3Q)相比，本专利技术的突变体在毕赤酵母宿主中的表达量高。在本专利技术一个实施方案中，两种突变体重组菌在相同条件下， Pfs25-3E表达量占上清中分泌蛋白的70%，Pfs25-3Q仅为16%。由于本专利技术的突变体在酵母中高表达的特性，在利用发酵罐培养过程中，发酵体系只需补加葡萄糖即可，而且24h后就可以获得表达产物，本专利技术的突变体大大简化了发酵培养工艺，缩短了培养周期。另一方面，由于本专利技术的突变体表达量占上清中分泌蛋白的 70%，仅用一步离子交换层析(1. OM NaCl洗脱)即可从表达上清中分离出目标蛋白峰，得到纯度达95%以上的目标蛋白。如果采用离子交换层析(0.3M NaCl洗脱)、凝胶过滤层析两步纯化，即可得到纯度达95%以上的目标蛋白，较一步法实现更高的收率。因此，本专利技术的突变体的高表达特性大大简化了纯化工艺。总体而言，本专利技术的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，与Pfs25标准蛋白具有相同的免疫原性，能够在毕赤酵母中高表达，有望成为优异的疟疾传播阻断疫苗的候选抗原。附图说明图1 重组表达质粒pfs25_3E/pGAPZ α A酶切鉴定泳道1 :DL2000DNA marker, 2000，1000，750，500，250，100泳道2 =XhoI 和 XbaI 双切 pfs25_3E/pGAPZ α A 重组质粒图2 从重组酵母菌pfs25_3E/pGAPZ α A/G中PCR鉴定pfs25基因泳道1 :pGAPZ α A/G酵母菌(阴性对照)泳道2 :DL2000DNA marker泳道3 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组酵母菌图 3 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 72 小时表达上清 SDS-PAGE 分析泳道 1 :protein marker (kd) :96，67，43，31，21，14 泳道2 :pfs25标准蛋白泳道3-8 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G阳性克隆表达产物泳道9 :pGAPZ α A/G酵母菌(阴性对照)图 4 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组菌表达产物 Western-blot 鉴定泳道1 :pGAPZ α A/G (阴性对照)泳道2 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G重组菌M小时表达泳道3 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组菌 48 小时表达泳道4 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组菌 72 小时表达泳道5 :pfs25标准蛋白图5 :pfs25-3Q/pGAPZ α A/G 重组菌表达分析泳道1 :pfs25标准品；泳道2-10 :Q2-Q 10克隆重本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种恶性疟原虫Ｐｆｓ２５蛋白突变体，该突变体具有ＳＥＱ１所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，蒋琳，雷清，杨军，高雪峰，应连芳，刘晓，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：62
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