一种基于９６孔板的植酸酶高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了基于９６孔板的植酸酶高通量筛选方法，包含以下步骤：Ａ１，获得突变植酸酶基因；突变模板的准备；Ａ２，植酸酶毕赤酵母突变体库的构建；Ａ３，基于９６孔板方法的植酸酶高通量筛选；建立了在９６孔板上进行毕赤酵母生长表达及植酸酶微量测定，构建高通量的植酸酶基因工程菌微量酶活测定方法。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于９６孔板的植酸酶高通量筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：　　Ａ１，获得突变植酸酶基因；突变模板的准备：接种一环含有ｐＵＣ１８－ｐｈｙＡ质粒的大肠杆菌ＤＨ５α于１０ｍＬ－ＬＢ液体培养基中，３７℃培养过夜，提取ｐＵＣ１８－ｐｈｙＡ质粒；提取到的质粒通过ＥｃｏＲ－Ｉ，Ｋｐｎ－Ｉ双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错ＰＣＲ的模板；通过引物　　Ｐ１：５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＣ－３’　　和Ｐ２：５’－ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＴＣＣ－３’进行易错ＰＣＲ；易错ＰＣＲ反应结束后使用纯化试剂盒对易错ＰＣＲ产物进行纯化回收；　　Ａ２，植酸酶毕赤酵母突变体库的构建；将步骤Ａ１回收的所述易错ＰＣＲ产物经ＥｃｏＲ－Ｉ，Ｋｐｎ－Ｉ双酶切后，连入同样经过双酶切的含有ＡＯＸ１启动子和氨苄青霉素、卡那霉素抗性基因的表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ中；使用电击转化的方法，将含有突变的植酸酶基因库的表达载体质粒转入毕赤酵母ＧＳ１１５感受态细胞中，通过ＭＤ平板筛选出阳性转化子；　　Ａ３，基于９６孔板方法的植酸酶高通量筛选；挑取经ＭＤ平板筛选出的阳性转化子入每孔含有ＢＭＧＹ液体培养基的９６孔深孔培养板，每一孔对应一个阳性转化子，２８－３０℃、２５０－３００ｒｐｍ培养至ＯＤ↓［６００］为２－６；再向每孔中加入ＢＭＭＹ液体培养基２８－３０℃、２５０－３００ｒｐｍ进行诱导产酶，每隔１２小时加入甲醇使培养基甲醇浓度保持在５％，诱导３６－４８小时后离心取上清液作为粗酶液；将每孔的上清液对应转入事先准备的９６孔酶标板，用乙酸缓冲液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．６）进行１００倍稀释，测定酶活；采用钼钒法测定植酸酶酶活性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈惠，曾民，廖燕，吴琦，吴振芳，韩学易，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]