本发明专利技术涉及一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31及其筛选方法，利用基因组改组技术筛选耐高温、耐酒精、耐酸的高产酒精酵母诱变株的方法，步骤如下：对三株酵母菌株进行紫外线诱变，采用TTC法一级筛选、杜氏管发酵法二级筛选、摇瓶发酵法三级筛选，选出具有三种耐性且酒精产量明显提高的10株酵母突变株，对其进行原生质体制备，经过三轮的基因组改组，最终得到了对温度、酒精和酸耐性都有较大提高的酵母突变菌株TT31，该突变株在35℃条件下，以蔗糖为碳源进行酒精发酵72h，酒精产量达到了101.9g/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物育种领域，尤其是一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31及其筛选方法。
技术介绍
乙醇(俗称酒精)是一种重要的工业原料，广泛用于化工、食品、饮料工业、军工、 日用化工和医药卫生等领域。近年来，由于石油基燃料作为汽车燃油的过度消费，已经引起了严重的环境污染。乙醇作为清洁和可再生能源，在汽油中添加乙醇用作液体燃料替代或部分替代汽油，不但可以减少汽油用量，还可以降低环境污染。目前，将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为燃料乙醇，已成为解决能源危机的一条理想途径，而选育优良的微生物菌种是提高乙醇转化生产效率、降低生产成本的关键。酿酒酵母是传统的酒精生产菌株，具备良好的工业生产性状，耗糖快、乙醇耐受力较高、对水解糖液中有毒物质的抗性强。酿酒酵母属于子囊菌亚门中的酵母菌科成员，主要以芽殖方式繁殖，是一种形态结构较为简单的单细胞真核微生物。在自然界中，酵母主要分布在含糖量较高的偏酸性环境中。发酵工业是以微生物菌种为核心组织生产的，菌种是发酵工业的关键。酒精发酵过程中，通过糖酵解途径，酵母菌将葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳。但是，酵母菌传统的最适发酵温度一般在间，一般不超过36°C，该因素增加了发酵法生产乙醇的生产成本，甚至在部分气温较高地区无法进行正常生产；在酒精发酵过程中，发酵液中的酒精逐步积累，当其浓度达到一定值时，便会抑制细胞生长、存活与发酵作用，酵母菌发酵生产酒精能力便受到抑制；为避免染菌，可在酸性条件下进行酒精发酵。诱变、原生质体融合等传统育种技术，可在酵母耐性机制尚不明确时选育耐性菌株，克服酸性HSpH)条件发酵时酒精生产效率低的缺陷，因此，选育优良的多耐性酵母菌株，既能大幅度地提高乙醇的发酵产率，又能提高乙醇产业的经济效益，对推动乙醇发酵工业发展具有重要意义。工业微生物遗传育种的主要方法包括传统的自然选育和诱变育种，使菌种发生突变，存优去劣；另一方法是进行基因重组，使目的基因高效表达。传统的菌种改良技术，时间长，劳动强度大，需要多轮重组诱变和筛选。本研究所用菌株尚未被遗传表征，直接采用基因工程技术进行育种，同时提高其耐性和酒精产量存在诸多困难。基因组改组(Genome shuffling)技术是一种新型的育种技术，它将包含若干正突变株的突变体库作为每一轮原生质体融合的出发菌株，经过递推式的多轮融合，最终使引起正向突变的不同基因重组到同一个细胞株中，达到筛选优良酵母菌株的目的。相对于常规育种技术，利用基因组改组技术对微生物细胞进行选育，遗传信息量大，可大幅度提高微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度，使人们能够在较短的时间内获得高效的正向突变的菌株，不需要了解亲本的详细遗传背景，便于操作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种在高温、低PH条件下酒精产量高的高产酒精酵母突变株TT31及其筛选方法。 本专利技术实现目的的技术方案如下一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31，其特征在于保藏编号为CGMCC No. 4518 保藏日期2010年12月29日，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为酿酒酵母 Saccharomycescrevisiae0而且，所述突变株TT31最适发酵温度为35°C，最适发酵pH 4. 5，耐高温49°C，耐酒精20%，耐酸为pH2. 6。一种多耐性高产酒精酵母突变株TT31的筛选方法，步骤如下(1)出发菌株的紫夕卜线诱变对 Saccharomyces crevisiae spcl, Saccharomyces crevisiaeY14, Saccharomyces crevisiae S16三株酵母菌株进行紫外线诱变，取IOmL培养至对数期的菌悬液，加至带磁力棒的直径90mm的培养皿中，置于磁力搅拌器载物台上，距离为20cm，开启紫外灯，预热20min，开启搅拌器，打开皿盖，在紫外灯照射下搅拌并计时， 分别于Os、15s、30s、45s、60s、75s、90s各取ImL菌液，进行10倍系列稀释后，取0. ImL涂布于平板上，30°C培养2 3d后计数观察结果，选取80%致死率的诱变剂量，spcl为2分钟， Y14、S16为30s,再进行诱变；(2)诱变株的筛选酵母菌经紫外线诱变后，取0. ImL涂布于含乙醇浓度分别为 9%,10%,11%,12%,13%,14%的平板上，分别置于30 V、35 °C培养箱中，培养2 3d，挑取生长较快的菌株进行杜氏管耐酒精、耐酸及酒精发酵试验，从中选出耐酒精，耐酸及酒精产量较高的突变株tl、t2........tlO用于基因组改组；(3)诱变菌株的原生质体制备将tl、t2........tlO菌株分别接种于50mL YEPD液体培养基中，30°C，120r/min摇床培养12 16h，收集对数生长期细胞，各取5mL加入离心管中，3500r/min离心5min，用生理盐水洗涤两次，加入0. 2% β -巯基乙醇溶液，30°C，120r/ min振荡处理lOmin，用KCl高渗缓冲液(pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，添加KCl至 0. 7mol/L)洗涤三次，离心弃去上清液，加入2%的蜗牛酶液5mL，渗透压稳定剂为0. 5mol/L蔗糖，30°C，120r/min振荡下酶解1. 5h，每隔0. 5h取样进行镜检观察，待视野中90%以上为原生质体时，2000r/min离心lOmin，用KCl高渗缓冲液洗涤两次，离心收集原生质体；(4)第一轮基因组改组各取0. 5mL tl、t2........tlO菌株的原生质体，浓度为IO6个/mL,混合，30°C振荡处理15min, 2000r/min离心lOmin,收集细胞，加入2mL 35% PEG-4000 促融剂，300C，120r/min 振荡处理 20min，2000r/min 离心 lOmin，用 KCl 高渗缓冲液洗涤两次，取0. ImL菌液涂布于再生培养基(YEPD琼脂培养基，添加蔗糖至0. 5mol/L)平板上，分别置于441、451、461和47°C恒温培养箱中培养2 3d，待长出菌落后覆盖一层 TTC上层培养基，避光保温2 3h，比较各菌株间颜色深浅，实验重复3次，从中筛选出颜色较深的菌株，接种到内含杜氏管的酒精梯度试管中，酒精浓度分别为13% 17%，30°C培养36h。从中选出产气较快的株菌株进行摇瓶发酵试验，获得10株性状稳定的菌株，即第一轮融合菌株 Tl (T10、TlU.......T19)；(5)第二轮基因组改组将Tl代(T10、Tll........T19)融合菌株进行原生质体融合，涂布在再生培养基平板上，分别置于46°C、47°C、48°C和49°C恒温培养箱中培养2 3d，待长出菌落后覆盖一层TTC上层培养基，避光保温2 3h，比较各菌株间颜色深浅，实验重复3次，从中筛选出颜色较深的菌株，接种到内含杜氏管的酒精梯度试管中，酒精浓度分别为15% 19%，30°C培养36h。从中选出产气较快的菌株进行摇瓶发酵试验，获得10株性状稳定的菌株，即第二轮融合菌株T2 (T20、T21........T29)；(6)第三轮基因组改组将T2代融合菌株(T20、T21.本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多耐性高产酒精酵母突变株ＴＴ３１，其特征在于：保藏编号为：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５１８，保藏日期：２０１０年１２月２９日，保藏地址为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路１号院３号，分类命名为酿酒酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｅｖｉｓｉａｅ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王昌禄，潘静，李风娟，王玉荣，陈勉华，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12
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