防龋转基因植物疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种防龋转基因植物疫苗及其制备方法。所述防龋转基因植物疫苗由经防龋DNA序列表达获得，该防龋DNA序列包括变异链球菌UA159的致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因，以及番茄果实特异性启动子基因E8。将防龋DNA序列转化番茄后，获得的转基因番茄中表达大量防龋植物蛋白，可作为一种可食用的防龋转基因植物疫苗。该防龋转基因植物疫苗可刺激机体免疫应答，产生抗体，尤其是能刺激大鼠产生特异性SIgA和IgG抗体，阻断变异链球菌的粘附和菌斑的形成，能够抑制大鼠龋齿的发生，从而预防龋病，尤其是非蔗糖依赖型龋病。

【技术实现步骤摘要】
防龋转基因植物疫苗及其制备方法本专利技术属于口腔预防医学
，具体涉及一种防龋转基因植物疫苗及其制备方法。
技术介绍
龋病(Dentalcaries)是人类最常见的口腔疾病之一，与同心血管疾病、癌症并称为人类三大疾病，严重威胁着人们的口腔健康。目前在我国龋病发生率有上升趋势，老年人群患龋率高达98.40％，龋均14.65颗。找到控制龋病的有效措施仍是当前非常紧迫的任务。但龋病又是一种非致死性疾病，在寻找控制龋病的有效免疫措施时，必须充分考虑治疗方案以及使用制剂的高效、安全、价廉物美，以及预防接种方法易于被人群接受。变异链球菌(Streptococcusmutans)为革兰氏染色阳性的球菌，能够与牙面紧密粘附并定植于牙面，产生酸性代谢产物，引起牙齿脱矿，最终导致龋病发生。变异链球菌是导致人类龋病的一类主要致病菌。变异链球菌壁相关蛋白A(wall-associatedproteinAgene,wapA)、葡聚糖结合蛋白(glucan-bindproteins,GBPs)、致龋毒力因子的表面蛋白(surfaceproteinantigen,PAc)和葡糖基转移酶(glucosyltranferaes,GTFs)是变异链球菌的重要抗原物质。这些抗原成分参与介导细菌的粘附，在免疫学方面有着极为重要的意义。其中，表面蛋白(PAc)和葡糖基转移酶(GTFs)是变异链球菌中最重要的致龋毒力因子。表面蛋白是变异链球菌的主要粘结素，介导牙面的非蔗糖依赖型粘附。研究认为，表面蛋白(PAc)结构中的A区是主要粘附功能区，可与糖蛋白结合，介导变异链球菌对牙面的初始附着。表面蛋白(PAc)结构中的A区富集T、B细胞表位，是研制防龋疫苗的主要靶点抗原。研究表明，当变异链球菌毒力因子PAc作为抗原免疫动物后，机体的体液免疫和黏膜免疫应答被激发，产生特异性的抗体，初步证明利用PAc免疫动物后，可有效抑制细菌在牙面的粘附，从而降低患龋率。葡糖基转移酶(GTFs)作为另一种主要的致龋毒力因子，可通过蔗糖合成葡聚糖，介导细菌在牙面的蔗糖依赖型粘附。GTFs包含两个免疫活性区，能使变异链球菌与牙面紧密结合，分别是葡聚糖结合区(glucanbindingregion,GLU)和催化功能区(catalyticregion,CAT)。PAc和GTFs是变异链球菌致病的主要毒力因子，在其分子中存在着相应的粘附功能区以及具有免疫原性的T、B细胞抗原决定簇，能诱导产生特异性唾液sIgA抗体，sIgA抗体可以抑制这两种毒力因子的功能，阻止变异链球菌在牙面附着，从而抑制龋病的发生和发展。IgG抗体也具有抑制龋病的发生和发展的重要作用。霍乱毒素B亚单位(CTB)是一种较理想的免疫佐剂，它能与抗原呈递细胞(antigenpresentingcells，APC)等有核细胞表面神经节苷脂GM1受体特异性结合，具有调节APC反应、T细胞反应和抗体产生的作用，能诱导机体产生强烈的系统和局部粘膜免疫应答，在疫苗的研究中已被广泛的使用。免疫应答反应主要分为初次应答和再次应答。初次应答时，机体仅产生少量抗体且抗体生成缓慢，而再次应答时机体迅速发生免疫应答，产生大量的抗体。再次免疫应答是由记忆性B细胞(memoryBcell,Bm)诱导。Bm是初次免疫应答后克隆消除保留下来的高亲和力细胞，当再次受同一抗原刺激，Bm快速分化成浆细胞，介导迅速的记忆性应答，产生高滴度的抗体，同时维持Bm库的更新。Bm在体液免疫中扮演十分重要的角色，对浆细胞的产生、抗体的生成、记忆持久的免疫保护起关键作用；预示诱导尽可能多的Bm形成是加强转基因植物口服疫苗黏膜免疫效果的有效策略。无功能糖基转移酶样蛋白(DOCK8)是GTP-交换因子Rho-Rac家族成员之一，其核心功能区是DHR。在静息B细胞遭遇抗原时，DOCK8促进抗原信号存留，促使B细胞进入淋巴结的生发中心，并分化为长效Bm，维持长效免疫。B细胞还通过自身表达的DOCK8分子招募胞内的整合素ICAM-1向Th细胞和B细胞间的免疫突触区域聚集，促进Th细胞活化B细胞第二信号的传导，发挥生物活性作用。预示DOCK8可能是Bm形成及其在体内长期留存的关键。近年来各种转基因技术的创立和改进，使基因的转移以及转基因植物的再生不再是转基因植物可食疫苗研究的限制因素；基因转入宿主后的高效表达及其遗传稳定性、表达蛋白的抗原性和免疫反应性、口服免疫机制、提高植物表达蛋白的利用率、利用安全筛选标记或删除选择标记的策略、培育安全的转基因植物等问题，是当前转基因植物口服疫苗研究的关键。转基因植株中实现高效表达和维持稳定遗传主要与植物表达载体、转化方法、外植体以及外界环境因素有关。随着对转基因植物的深入研究发现，大量外源基因并没有得到预期表达，不同转基因个体中外源基因的表达也存在较大差异，这种基因表达差异不仅受到不同强度启动子的调控，而且转录水平的抑制和转录后mRNA积累的抑制也会造成不同程度地基因沉默。目前，还没有相关文献报道将致龋毒力因子的表面蛋白(PAc)粘附相关肽段和葡糖基转移酶(GTFs)催化功能区基因，以及免疫佐剂CTB和靶向蛋白DOCK8核心功能区基因，番茄果实特异性启动子基因E8和双元穿梭载体pCAMBIA2301质粒用于制备重组质粒，同时利用转基因技术将所获得的重组质粒转化番茄，培育防龋转基因番茄，用于龋病防治的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的防龋DNA序列；进一步地，将该防龋DNA序列转化番茄，培育防龋转基因番茄，以获得防龋转基因植物疫苗，用于龋病防治的研究。一方面，本专利技术提供了一种新型防龋DNA序列，该DNA序列包括变异链球菌UA159的致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因，以及番茄果实特异性启动子基因E8。本专利技术提供了上述防龋DNA序列的制备方法，包括以下步骤：1)、将上述E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段来构建融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，2)、将该融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR插入到pCAMBIA2301双元穿梭载体中，构建pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒，3)、将该pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒转化感受态细胞E.coliJM109；获得所述防龋DNA序列。经鉴定及测序，所述防龋DNA序列如SEQIDNo1所示。单纯的核苷酸序列进入人体后容易被核酸酶降解，较难进入细胞，导致DNA序列的防龋效果降低。进一步地，本专利技术将上述防龋DNA序列转化番茄，并培育获得防龋转基因番茄，利用植物系统表达重组蛋白，因此，可作为一种防龋转基因植物疫苗。再一方面，本专利技术提供了一种防龋转基因植物疫苗及其制备方法。利用了上述防龋DNA序列中的番茄果实特异性启动子E8基因能够启动融合蛋白的表达。在一种实施方案中，提供了将上述防龋DNA序列转化番茄，转化方法包括步骤：1)、将上述DNA序列经添加植物信号肽、内质网靶向序列和柔性肽基因修饰后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防龋DNA序列，该DNA序列包括变异链球菌UA159的致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因，以及番茄果实特异性启动子基因E8。

【技术特征摘要】
1.一种防龋DNA序列，该DNA序列包括变异链球菌UA159的致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因，以及番茄果实特异性启动子基因E8。2.根据权利要求1所述的防龋DNA序列的制备方法，包括以下步骤：1)、将上述E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段来构建融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，2)、将该融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR插入到pCAMBIA2301双元穿梭载体中，构建pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒，3)、将该pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒转化感受态细胞E.coliJM109；获得所述防龋DNA序列。3.根据权利要求2的制备方法，所述防龋DNA序列如SEQIDNo1所示。4.将权利要求1-3任意一项所述的防龋DNA序列转化番茄，并培育获得防龋转基因番茄的转化方法。5.根据权利要求4所述的转化方法，包括步骤：1)、将上述DNA序列经添加植物信号肽、内质网靶向序列和柔性肽基因修饰后，插入携带番茄果实特异性启动子的植物表达载体中，构建稳定高效的转基因植物表达质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR并转化番茄，2)、将选择性标记基因Km和GUS去除，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建国，管晓燕，田源，喻正文，白国辉，吴家媛，王方远，吴明松，王倩，陈彬，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52